基于TROP2靶向磁性纳米颗粒的乳腺癌循环肿瘤细胞检测新方法建立及其临床意义

《BMC Cancer》：Establishment of a new method for detection of TROP2-positive circulating tumor cells in breast cancer

本研究针对乳腺癌(BC)患者TROP2表达动态监测的临床需求，开发了基于TROP2靶向磁性纳米颗粒(TROP2@MNPs)的循环肿瘤细胞(CTCs)捕获新平台。研究团队利用TUMOR-FISHER技术平台，建立了TROP2阳性CTC的定量分析方法，并通过临床样本验证证实该方法能有效捕获EpCAM阴性而TROP2阳性的CTC亚群。研究结果显示TROP2@MNPs捕获的CTCTROP2+数量与组织免疫组化(IHC)评分显著相关(r=0.9871, p<0.01)，为TROP2靶向药物治疗提供了重要的液体活检解决方案。

　　

乳腺癌作为全球发病率第二的恶性肿瘤，2022年新发病例超过230万，给社会带来沉重负担。特别是三阴性乳腺癌(TNBC)患者，由于缺乏HER-2和激素受体靶点，治疗选择有限，预后较差。近年来，滋养层细胞表面抗原2(TROP2)作为新兴的治疗靶点受到广泛关注，其在乳腺癌尤其是TNBC中高表达，为患者提供了新的治疗希望。

然而，传统组织活检存在侵入性、无法动态监测等局限性，而基于上皮细胞粘附分子(EpCAM)的循环肿瘤细胞(CTCs)检测方法可能遗漏发生上皮-间质转化(EMT)的CTC亚群。这些细胞往往表达TROP2但不表达EpCAM，导致重要临床信息的丢失。因此，开发能够准确反映肿瘤TROP2表达状态的液体活检方法具有重要临床意义。

针对这一挑战，Wang等研究人员在《BMC Cancer》上发表了创新性研究，建立了基于TROP2靶向的新型CTC检测平台。研究团队首先优化了TROP2定量分析方法，通过流式细胞术和免疫荧光验证了TROP2在乳腺癌细胞系中的表达特征。随后开发了TROP2抗体修饰的磁性纳米颗粒(TROP2@MNPs)，并系统评估了其捕获效率、特异性和稳定性。

关键技术方法包括：利用TUMOR-FISHER平台建立CTC检测体系；制备和表征TROP2@MNPs；通过细胞系加标实验验证捕获效率；使用免疫荧光和Western blot分析蛋白表达；基于DISCO数据库进行生物信息学分析；收集11例乳腺癌患者和6例健康志愿者外周血样本进行临床验证。

建立TROP2定量分析方法

研究人员首先在MDA-MB-453乳腺癌细胞和健康供者外周血单个核细胞(PBMCs)中验证TROP2表达。流式细胞术显示TROP2在乳腺癌细胞中高表达，而在PBMCs中几乎不表达。通过浓度梯度实验确定最佳抗体浓度为1.25μg/mL。免疫荧光证实乳腺癌细胞表现为EpCAM⁺/CK⁺/CD45^-/TROP2⁺表型，而PBMCs为EpCAM^-/CK^-/CD45⁺/TROP2^-表型。

检测乳腺癌患者CTC中TROP2表达

在7例乳腺癌患者中，研究人员发现所有患者均存在TROP2阳性CTC，但同一患者不同CTC间存在异质性。比较发现CTC TROP2⁺数量与组织IHC评分有一定相关性，但TROP2平均荧光强度(MFI)与IHC评分无显著相关，提示EpCAM基础捕获方法在反映肿瘤TROP2表达谱方面存在局限。

TROP2@MNPs的表征

研究团队开发了TROP2靶向的CTC免疫磁珠富集平台。动态光散射显示抗体修饰后磁珠粒径增加，60分钟后趋于稳定。紫外可见光谱、透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)证实TROP2抗体成功连接至磁珠表面。荧光显微镜显示TROP2@MNPs能特异性吸附于乳腺癌细胞。

TROP2在乳腺癌中的表达分析

DISCO数据库分析显示，TROP2在多种乳腺癌细胞类型中高表达，且表达模式与EpCAM高度相似。在不同分子分型中，TROP2在TNBC、PR⁺和ER⁺乳腺癌中表达强度显著高于EpCAM。功能实验表明，敲低TROP2可降低MCF7细胞的迁移和侵袭能力。

体外捕获验证

研究人员在四种乳腺癌细胞系中评估TROP2@MNPs捕获效率。结果显示其对MDA-MB-453、MCF-7和MDA-MB-468细胞捕获效率高，而对TROP2低表达的MDA-MB-231细胞捕获效率较低。与EpCAM@MNPs相比，TROP2@MNPs对高表达TROP2的乳腺癌细胞捕获效率更高，且捕获率与TROP2表达水平显著相关。

捕获条件优化

通过浓度梯度实验确定最佳TROP2@MNPs浓度为10μg/mL，最佳孵育时间为60分钟。稳定性测试表明TROP2@MNPs在4℃下可保持4周稳定性。在PBS和全血环境中，TROP2@MNPs对不同浓度癌细胞的捕获效率无显著差异。钙黄绿素AM/PI染色显示捕获后细胞活性良好，证明TROP2@MNPs具有良好的生物相容性。

临床CTC捕获的初步探索

在4例乳腺癌患者和4例健康供者中，TROP2@MNPs捕获的CTCTROP2⁺数量在患者组显著高于对照组。值得注意的是，在患者8中，EpCAM基础方法未检测到CTC，而TROP2@MNPs检测到12个CTCTROP2⁺。相关性分析显示，TROP2@MNPs组捕获的CTCTROP2⁺数量与IHC评分高度相关(r=0.9871, p<0.01)，而EpCAM@MNPs组无此相关性。

本研究建立的TROP2@MNPs捕获方法突破了传统EpCAM基础检测的局限，能够有效捕获EpCAM阴性而TROP2阳性的CTC亚群。该方法具有良好的特异性、灵敏度和生物相容性，为乳腺癌患者TROP2靶向治疗提供了可靠的液体活检工具。特别重要的是，TROP2@MNPs捕获的CTCTROP2⁺与组织IHC结果高度一致，使其有望成为动态监测TROP2表达状态的有效手段。

该研究的创新性在于首次将TROP2直接作为CTC捕获靶点，克服了EMT导致的EpCAM表达下调对检测灵敏度的影响。随着TROP2靶向药物如sacituzumab govitecan在临床的应用，这一检测平台将为患者筛选、疗效监测和预后评估提供重要依据，推动乳腺癌精准治疗的发展。