点亮锌原子：用于生物成像的可切换探针

《Analytical Methods》：Lighting up zinc: switchable probes for biological imaging

锌离子荧光探针设计与生物成像应用

　　锌是一种在人体中含量仅次于铁的微量元素，主要以二价形式（Zn2?）存在，占人体总质量的约0.004%。它在多种生理过程中发挥着关键作用，包括新陈代谢、神经传导、DNA合成、细胞凋亡调控、免疫反应以及酶的活性。由于锌在这些过程中的核心地位，维持其体内平衡对于健康至关重要。锌缺乏会导致发育迟缓、免疫功能受损、代谢紊乱以及某些癌症的易感性增加。而锌过量则可能引发毒性反应，并与多种神经退行性疾病如阿尔茨海默病、家族性肌萎缩侧索硬化症和帕金森病的发生有关。

这些对比结果突显了对锌浓度进行精确、敏感和选择性检测的重要性，特别是在生物和环境样本中。目前，锌补充剂（如醋酸锌）因其在生理条件下（pH 7.4）的高生物利用度（约100%）而被广泛用于纠正锌缺乏。此外，醋酸锌在某些癌症的诊断和治疗中也具有应用价值，例如用于监测肿瘤生长的注射制剂。荧光检测技术已成为识别和量化过渡金属离子（特别是Zn2?）的首选方法之一，因其具有高灵敏度、实时监测能力和微创特性，被广泛应用于细胞生物学、纳米技术和环境科学等领域。

荧光探针通常由三个功能模块组成：（1）荧光团，用于在激发后产生可测量的发射；（2）识别基团，用于特异性结合目标分析物；（3）连接基团，将荧光团与识别基团连接起来。当探针与目标分子（如Zn2?）发生相互作用时，识别事件会引发结构或电子变化，从而激活荧光团，产生可检测的荧光响应。探针的灵敏度和选择性高度依赖于荧光团核心的电子结构及其与目标分子的相互作用。

在本研究中，我们设计并合成了四种基于吡啶的荧光探针，它们的分子量均小于等于320 amu，具有对Zn2?离子的高亲和力和选择性。这些探针是通过将水杨醛与四种不同的吡啶衍生物（5-氨基吡啶-2-羧酸、2-氨基-3-氯-5-三氟甲基吡啶、5-氨基-2-三氟甲基吡啶和2-氨基-3-羟基吡啶）进行缩合反应制备而成。通过核磁共振光谱（1H NMR）确认了合成化合物的结构，其特征为在8.66–5.50 ppm范围内出现尖锐的单线信号，表明形成了具有电子富集特性的席夫碱（–C=N–）官能团。探针的纯度通过熔点和质谱分析进一步验证。

在确定结构后，我们评估了探针在Zn2?存在下的紫外-可见吸收和荧光响应。席夫碱因其电子丰富的–C=N–官能团而被广泛用作金属离子配体，能够与多种金属离子形成稳定的配合物。通过将供体和受体基团通过共轭π系统连接，可以实现荧光增强，这一过程通常与分子内电荷转移（ICT）有关。合成的探针在Zn2?存在下表现出显著的荧光增强，表明其具有作为金属离子传感器的潜力。

在甲醇溶液中，探针1的浓度为1.0 × 10?3 mM，锌醋酸盐溶液同样为1.0 × 10?3 mM。值得注意的是，探针1的紫外-可见吸收光谱在添加Zn2?后未发生明显变化，这表明其基态电子跃迁受到的影响较小。然而，其荧光光谱在Zn2?作用下发生了显著变化，自由探针1在约360 nm波长下表现出中等的发射强度，而在添加Zn2?后，其荧光强度增加了约4.5倍，表明其在金属结合后实现了显著的“荧光开启”效应。为了验证探针1对Zn2?的高选择性，我们将其与四种不同的金属离子（Zn2?、Mn2?、Cu2?和Ca2?）进行反应。在紫外光（短波和长波）照射下，只有Zn2?与探针1形成的配合物表现出明亮的绿色荧光，而其他金属离子则未引起明显的发射变化，这进一步表明探针1对Zn2?具有高度选择性。

此外，通过滴定实验（0–1.0当量）进一步研究了探针1在甲醇溶液中与Zn2?的定量响应。随着Zn2?浓度的增加，发射强度呈现出浓度依赖性变化，特别是在282 nm激发下，366 nm处出现了一个强峰，表明探针能够准确响应Zn2?浓度。探针2、3和4在Zn2?存在下也表现出显著的荧光增强，其吸收最大值分别为306 nm、342 nm和358 nm，而对应的发射最大值分别为580 nm、500 nm和520 nm。在添加Zn2?后，探针2的吸收最大值未发生变化，但探针3的吸收最大值发生了轻微的红移（342–348 nm），而探针4的吸收最大值从358 nm显著红移到432 nm，表明其结构对Zn2?的结合具有较高的敏感性。

为了深入了解这些基于吡啶的荧光探针在锌存在下的光化学特性，我们利用Gaussian 16程序进行了计算研究。计算了合成探针的优化分子几何结构、分子轨道分布以及激发能，以阐明其电子结构和光物理性质。优化后的结构显示，探针1的最高占据分子轨道（HOMO）电子密度主要集中在氨基吡啶环上，而HOMO?1、LUMO和LUMO+1的电子密度则在整个分子结构中分布。这种电子密度的扩展表明了分子内电荷转移（ICT）的高效性，暗示了电子转移过程的便利性。当探针1与Zn2?结合后，其分子轨道分布发生了显著变化，HOMO电子密度主要集中在Zn原子上，而HOMO?1则在水杨醛环上表现出明显的电子密度扩展。相比之下，LUMO电子密度在整个分子结构中分布，而LUMO?1则在氨基吡啶和水杨醛环之间分布。这些结果表明，Zn2?的引入显著改变了探针的电子结构，从而促进了分子内电荷转移，增强了发射强度。

通过时间依赖密度泛函理论（TD-DFT）计算的紫外-可见光谱显示，起始材料、探针1和探针1+Zn的吸收最大值分别为220 nm、300 nm和362 nm。探针1+Zn的吸收光谱相比探针1出现了明显的红移，这是由于Zn原子的引入导致电子密度重新分布，特别是在金属中心的局部化。这种增强的ICT过程使得探针1+Zn的荧光强度显著提高，这一特性使其在生物成像中具有重要的应用潜力。探针的强荧光发射归因于Zn原子对电荷转移的高效促进，使其成为一种理想的锌检测探针。

在细胞成像实验中，我们成功地利用探针1区分了正常前列腺细胞与恶性前列腺细胞。在添加探针1后，肿瘤细胞的荧光强度明显低于正常细胞，这反映了其细胞内锌含量的减少。为了评估探针1在细胞内对Zn2?的敏感性，我们将前列腺癌细胞与已知浓度的醋酸锌溶液（50 μM）共同培养，并使用探针1（10–20 μM）进行标记。通过共聚焦显微镜获取了固定细胞（PC-404为正常，PC-408为肿瘤）的图像。荧光强度的变化表明，探针能够有效地响应细胞内的锌浓度，进一步验证了其在生物成像中的应用潜力。

此外，研究还指出，前列腺组织中锌的浓度是人体其他组织中最高的，约为3到10倍。然而，在前列腺癌（PC）中，锌的水平显著降低。多项研究表明，癌变前列腺组织中的锌浓度可比健康组织减少高达六倍。目前，前列腺特异性抗原（PSA）是前列腺癌诊断的主要生物标志物，但由于其特异性有限，常常导致过度诊断和治疗。相比之下，前列腺癌的一个最一致的生化特征是细胞内锌水平的显著下降。这种锌积累和分泌能力的减弱为早期检测该疾病提供了新的思路。

综上所述，本研究设计并合成了具有高亲和力和选择性的基于席夫碱的小分子荧光探针，用于检测Zn2?离子。这些探针在Zn2?结合后表现出显著的荧光增强，主要由螯合增强荧光（CHEF）和抑制光诱导电子转移（PET）机制驱动。其中，探针1对Zn2?表现出优异的灵敏度和选择性，且在与其他生物相关金属离子的反应中表现出较低的干扰。密度泛函理论（DFT）计算结果与实验数据一致，表明Zn2?的结合改变了探针的电子结构，促进了分子内电荷转移，从而增强了发射强度。细胞成像实验进一步验证了探针能够根据细胞内Zn2?的浓度差异区分正常与恶性前列腺细胞，凸显了其在锌敏感诊断工具中的应用前景。

这些研究结果不仅展示了小分子荧光探针在生物系统中实时监测Zn2?的潜力，还为早期检测与锌相关疾病如前列腺癌和乳腺癌提供了新的方法。未来，随着对锌生物学研究的深入，这类高效、灵敏的探针有望在生物医学领域发挥更大的作用，为疾病的诊断和治疗提供支持。同时，其在环境监测和纳米技术中的应用也为相关领域的研究提供了新的工具。