通过优化被动采样器的使用，实现了对污水中SARS-CoV-2变异株BA.4和BA.5的早期检测

《Environmental Science: Water Research & Technology》：Optimised use of passive samplers enabled early detection of SARS-CoV-2 variants BA.4 and BA.5 in sewage water

本研究通过在法国两个城市同步进行被动采样（尼龙膜）和抓取采样，优化了病毒回收方法，并利用ARTIC PCR和Illumina测序分析，证明了被动采样在早期检测奥密克戎BA.4和BA.5变种中的有效性，为废水监测提供了新方法。

　　在新冠疫情的背景下，废水流行病学（Wastewater-based epidemiology, WBE）作为一种新的病毒监测手段逐渐受到重视。该方法通过检测城市排水系统中的病毒RNA，能够追踪病毒在人群中的传播情况，尤其在常规筛查覆盖率较低的情况下，WBE为公共卫生提供了重要的补充数据。然而，由于某些病毒在废水中的浓度较低，传统的采集方法可能无法有效捕获足够的病毒基因组信息，这使得如何优化采集策略成为一个亟待解决的问题。近年来，基于膜的被动采样技术因其部署简便、成本低廉等优点，被认为是替代自动采样器的理想选择。特别是在自动采样器难以应用的场景下，这种技术可以为大规模监测网络的建设提供支持。

本研究聚焦于通过被动采样与抓取采样（grab sampling）相结合的方式，评估这两种方法在检测SARS-CoV-2病毒及其变种（如Omicron亚变种）方面的性能。研究在法国的两个大型城市——里昂和南特——的下水道中进行了平行采样。其中，里昂的采样时间为2022年4月12日和4月14日，南特则为5月18日和5月20日。为了保证采样数据的代表性，研究者选择了四个社区采样点，并在每个采样点部署了一个基于3D打印的被动采样装置——SARS-CoV-2污水采样笼（COSCa），这是一种设计用于促进非限制性水流的空心球体，具有26个直径为1.5 cm的孔洞。每个COSCa装置内部放置了一块8.5 cm直径的尼龙膜，用于吸附病毒颗粒。采样完成后，通过将COSCa从污水中取出，进行膜的清洗和后续处理，以获取病毒核酸。同时，研究者也对同一地点进行了抓取采样，收集了1 L污水样本，进行实验室处理与分析。

为了评估尼龙膜对病毒的吸附与释放效果，研究者对两种不同的病毒恢复方法进行了比较：一种是使用Tween 20缓冲液进行提取，另一种是直接裂解法。通过实验室实验，研究者发现无论是使用Tween 20提取还是结合超声波处理（sonication），病毒恢复效率都低于直接裂解法。这一发现对于实际应用具有重要意义，因为它表明在某些情况下，直接裂解可能是更优的选择。此外，研究者还发现，两种采样方法在病毒浓度和基因组覆盖度方面表现相近，特别是在使用ARTIC V4.1多重PCR技术进行深度测序时，能够实现接近完整的基因组覆盖，这为后续的病毒变异分析提供了可靠的依据。

在对尼龙膜与抓取样本进行基因组测序后，研究者发现，两种方法都能有效识别SARS-CoV-2的变异情况。通过分析不同基因区域的突变频率，研究者发现SARS-CoV-2在污水中的基因组覆盖度高达90%以上，而突变主要集中在S基因和ORF1ab区域，这些区域是病毒变异的热点。值得注意的是，研究者在样本中检测到了一些低频突变，这些突变可能与某些隐匿的病毒亚型有关。这表明，被动采样不仅能够捕捉到主流病毒变种，还可能揭示一些尚未被广泛记录的变异情况，从而为病毒的进化研究提供新的视角。

研究进一步揭示了被动采样在病毒变异早期检测中的潜力。通过对比法国两个城市的污水样本和人群中的病毒流行情况，研究者发现，被动采样能够比常规的人群筛查更早识别出SARS-CoV-2的某些亚变种，例如BA.4和BA.5。在南特，被动采样在BA.4和BA.5的首次出现时间上，比临床检测提前了三周。这表明，被动采样在病毒变异的早期预警方面具有显著优势，尤其是在病毒传播率较低的区域，传统的采样方法可能难以准确反映病毒的真实流行趋势。因此，这种技术为公共卫生部门提供了更早采取防控措施的机会。

此外，研究还探讨了被动采样与抓取采样在不同采样点和城市之间的表现差异。例如，在里昂的某些采样点，被动采样与抓取采样在病毒浓度上的相关性较低，这可能与污水中病毒的吸附特性有关。而南特的采样结果显示，两种方法在检测病毒浓度时具有较高的相似性。这一现象提示，被动采样在某些情况下可以作为抓取采样的有效替代，尤其是在需要长时间监测的场景中，被动采样能够持续吸附病毒，避免了单次采样可能带来的误差。

从方法学的角度来看，本研究的成果为废水流行病学的发展提供了重要的参考。首先，研究证实了尼龙膜在病毒吸附和释放过程中的有效性，尤其是在低浓度病毒样本的处理上。其次，通过比较不同采样方法的性能，研究者提出了更优化的病毒恢复策略，为后续的废水监测工作提供了科学依据。最后，研究展示了深度测序技术在病毒变异分析中的应用，尤其是在处理混合样本时，利用特定的算法（如VaRaPS）能够更准确地估算不同病毒亚型的比例，从而提高变异识别的敏感性和特异性。

在实际应用中，被动采样技术的推广面临一定的挑战。例如，如何确保采样膜在不同环境条件下具有稳定的吸附性能，以及如何提高病毒核酸提取的效率，以减少PCR抑制物对检测结果的影响。这些问题需要进一步的研究来解决。此外，由于被动采样通常不能提供精确的定量数据，因此其在病毒流行趋势分析中的应用仍需结合其他技术手段进行验证。然而，本研究的结果表明，被动采样在病毒变异的早期识别方面具有显著优势，尤其是在资源有限或自动采样器难以部署的地区，这种技术可以作为一种有效的补充工具。

本研究的意义不仅限于SARS-CoV-2的监测，它也为其他病毒的废水流行病学研究提供了借鉴。例如，研究者同时对诺如病毒（NoV GII）进行了检测，并发现两种采样方法在病毒检测上表现一致。这说明，被动采样技术可以应用于多种病原体的监测，为构建更全面的废水监测网络奠定了基础。同时，研究者还指出，病毒在污水中的吸附行为可能受到多种因素的影响，包括病毒类型、悬浮颗粒含量以及水质条件等。因此，针对不同病毒和不同环境条件，可能需要调整采样策略，以提高病毒检测的准确性和全面性。

从公共卫生角度来看，本研究的发现具有重要的现实意义。SARS-CoV-2的变异往往会影响病毒的传播能力和致病性，因此，早期识别变异株对于制定防控措施至关重要。通过废水监测，研究者能够及时发现病毒的变异趋势，为公共卫生决策提供数据支持。此外，研究还表明，被动采样可以在资源有限的情况下，以较低的成本实现对病毒的持续监测，这在一些发展中国家或地区可能具有更高的可操作性。

综上所述，本研究通过对比被动采样与抓取采样的性能，验证了尼龙膜在病毒检测中的有效性，并展示了其在病毒变异早期识别中的潜力。研究不仅为废水流行病学技术的优化提供了新的思路，也为公共卫生监测系统的设计和运行提供了科学依据。未来，随着技术的进一步发展，被动采样有望成为一种更加广泛应用的病毒监测手段，特别是在应对突发公共卫生事件和病毒变异监测方面。