批量分离分析揭示了与科罗拉多马铃薯甲虫对吡虫啉抗性相关的基因组区域

《Ecology and Evolution》：Bulk Segregant Analysis Reveals Genomic Regions Associated With Imidacloprid Resistance in the Colorado Potato Beetle

抗性基因鉴定与RNAi验证在Colorado potato beetle中对imidacloprid的影响研究。通过杂交近交线构建群体并采用Bulk Segregant Analysis（BSA）方法，在CPB的1、8、10、16号染色体上发现8个抗性QTL峰值，共鉴定337个候选基因。基于表达水平和功能注释筛选出ABC转运蛋白LdNA19763和半乳糖转移酶LdNA20673进行RNAi验证。然而，RNAi处理本身激活的分子机制导致实验结果复杂化，敲低目标基因并未显著改变抗药性，提示RNAi系统可能干扰抗性表型验证。本研究揭示了RNAi技术用于抗性机制验证的局限性，并明确了CPB抗药性研究的分子调控新方向。

　　本研究聚焦于一种对农业生产构成严重威胁的害虫——马铃薯瓢虫（Colorado potato beetle, CPB），探讨其对新烟碱类杀虫剂imidacloprid产生抗性的遗传基础。随着基因组技术的广泛应用，昆虫对杀虫剂的抗性进化速度加快，且抗性相关基因数量庞大，因此，对更多物种进行遗传机制研究变得尤为重要。尽管马铃薯瓢虫是重要的农业害虫，但目前针对其抗性的遗传图谱研究仍较为有限，尤其是基于杂交群体的基因定位研究。

研究团队采用了一种高效且经济的遗传分析方法——批量分离分析（Bulk Segregant Analysis, BSA），通过构建由五种欧洲马铃薯瓢虫菌株生成的先进杂交系（Advanced Intercross Lines,AIL）来识别与imidacloprid抗性相关的基因。BSA方法通过将表现出极端表型的个体进行分组，从而能够更高效地筛选出可能与抗性相关的基因区域。研究发现，有八个基因峰分布在第1、第8、第10和第16号染色体上，这些区域可能与imidacloprid抗性有关。通过对这些基因峰内的337个基因进行筛选，结合基因表达数据和功能注释，最终选择了三个候选基因进行进一步的功能验证。

在对这些候选基因的表达分析中，研究发现两种基因——一种是ABC转运蛋白（LdNA19763），另一种是半乳糖转移酶（LdNA20673）——在相对较易感的菌株E01中表达水平高于相对抗性菌株E06。这一发现与传统的代谢抗性模型相悖，通常认为抗性基因会表现出更高的表达水平，而易感个体的基因表达水平较低。然而，研究团队通过RNA干扰（RNAi）技术尝试验证这些基因在抗性中的作用，结果却出人意料：RNAi机制的激活本身反而降低了马铃薯瓢虫对imidacloprid的抗性，且这种影响并非局限于所选的候选基因。这一结果引发了对使用RNAi技术验证昆虫抗性机制的适用性的担忧。

RNAi作为一种经典的基因功能研究工具，其在昆虫中的应用已显示出显著的潜力，尤其是在鞘翅目昆虫中。然而，本研究的结果表明，RNAi的激活可能会对昆虫的生理状态产生广泛影响，从而干扰对特定基因抗性功能的判断。这意味着在使用RNAi进行抗性机制验证时，可能需要更加谨慎地设计实验，以排除由RNAi本身引起的非特异性反应。此外，研究中发现，即使在不涉及目标基因的情况下，RNAi处理也对昆虫的死亡率产生了显著影响，这可能表明RNAi技术在昆虫中不仅影响目标基因的表达，还可能影响其他生理过程，从而影响抗性表型的准确性。

这一发现具有重要的实际意义，尤其是在农业害虫管理领域。由于昆虫抗性机制的复杂性，传统方法如基于群体的遗传图谱分析往往难以完全揭示抗性基因的详细功能。而RNAi技术在某些昆虫中已被证明是一种有效的工具，但本研究揭示了其在某些情况下可能带来的干扰效应。这提示研究人员在使用RNAi进行抗性基因功能验证时，需要考虑RNAi本身可能对昆虫生理状态产生的影响，避免因实验设计不当而得出错误的结论。

此外，研究还指出，某些基因的表达水平与抗性之间的关系可能并不直观。例如，尽管LdNA19763和LdNA20673在易感菌株中表达较高，但它们的表达水平与抗性之间的因果关系并未得到明确证实。这可能意味着这些基因并非直接参与抗性机制，而是与某些调控过程相关，例如通过调控其他基因的表达间接影响昆虫对imidacloprid的反应。因此，进一步研究这些基因在昆虫抗性中的具体作用，以及它们与其他抗性相关基因之间的相互作用，对于全面理解马铃薯瓢虫的抗性机制至关重要。

在抗性基因筛选过程中，研究团队还发现了其他可能与抗性相关的候选基因，包括一些ABC转运蛋白、CYP酶、以及锌指蛋白等。这些基因的表达模式和功能注释为理解昆虫抗性的复杂机制提供了新的线索。然而，由于本研究的实验设计和结果分析中发现的干扰效应，进一步的实验验证需要更加精细的控制手段，例如使用更精确的RNAi靶向方法，或者采用其他互补的实验技术，如CRISPR-Cas9等，以确保结果的可靠性。

同时，研究还强调了基因表达数据在抗性基因筛选中的重要性。通过基因表达图谱（Gene Expression Atlas, GEA）对候选基因的筛选，有助于识别那些在不同菌株中表现出显著表达差异的基因。这不仅为抗性机制提供了新的视角，也为后续的功能验证奠定了基础。然而，本研究中发现的RNAi对昆虫生理的干扰效应表明，基因表达数据的解读需要结合其他实验数据，如昆虫对杀虫剂的敏感性测试结果，以全面评估基因的功能。

本研究的结果对未来的昆虫抗性研究具有重要的指导意义。首先，它提示在使用RNAi技术进行基因功能验证时，应充分考虑RNAi本身可能对昆虫生理产生的影响，特别是在抗性研究中，这种非特异性效应可能会掩盖或改变目标基因的真实功能。其次，研究结果也表明，抗性基因的表达模式可能并不总是符合传统预期，因此需要更全面的分析方法来揭示其在抗性中的具体作用。此外，该研究还揭示了昆虫抗性机制的复杂性，包括基因表达调控、代谢途径改变以及可能的其他非传统机制，这些都需要进一步的实验验证。

总的来说，本研究为马铃薯瓢虫对imidacloprid抗性的遗传机制提供了初步的线索，但同时也揭示了在使用RNAi技术进行抗性基因功能验证时可能存在的方法学挑战。未来的研究需要更加精细的实验设计和更全面的分析方法，以准确识别和验证抗性基因的功能。此外，随着基因组测序技术的不断进步，更多的非模型昆虫物种将成为研究抗性机制的潜在对象，这将有助于我们更好地理解昆虫抗性的遗传基础，并为可持续的害虫管理策略提供科学依据。