SARS-CoV-2核衣壳蛋白变异体具有不同的RNA伴侣活性

《The FEBS Journal》：SARS-CoV-2 nucleocapsid protein variants have differential RNA chaperone activity

单链RNA病毒基因组折叠受核衣壳蛋白（N蛋白）调控，其RNA伴侣活性依赖RBD、IDR2和CTD协同作用。研究发现Omicron BA.5变体的N蛋白因磷酸化修饰缺失导致RNA折叠能力下降，但模拟磷酸化状态可完全恢复其伴侣活性。该机制揭示磷酸化通过调节IDR2构象影响病毒RNA组装，为抗病毒药物设计提供新靶点。

　　SARS-CoV-2，即严重急性呼吸综合征冠状病毒2型，是一种具有单链RNA（ssRNA）基因组的病毒。其基因组长度约为30千碱基对（kb），在病毒生命周期中扮演着至关重要的角色。在病毒进入宿主细胞后，N蛋白（核衣壳蛋白）在RNA包装、病毒组装以及调控宿主免疫反应等方面发挥关键作用。然而，近年来的研究表明，N蛋白的功能不仅限于这些已知作用，它还可能具备一种新的能力——作为RNA伴侣蛋白，促进RNA的正确折叠。RNA伴侣蛋白在多种生物系统中被广泛研究，它们通常通过非特异性结合RNA，帮助其从错误的构象中恢复，最终形成稳定的结构。这种动态的RNA折叠过程对于RNA的生物学功能和与其他分子的相互作用至关重要。

在本研究中，科学家们首次系统地揭示了SARS-CoV-2 N蛋白的RNA伴侣活性，并探讨了其与磷酸化状态之间的关系。RNA伴侣蛋白通常缺乏稳定的三维结构，而是通过内源性无序区域（IDRs）进行功能调控。N蛋白由多个结构域组成，其中包含三个IDRs，分别位于RNA结合结构域（RBD）和C末端结构域（CTD）之间。研究人员发现，从氨基酸46到364的RBD-IDR2-CTD区域对于N蛋白的伴侣活性至关重要，而相邻的IDRs则可能增强或抑制该功能。这种发现表明，IDRs在RNA伴侣机制中具有不可忽视的作用。

为了进一步验证N蛋白的RNA伴侣活性，研究人员采用了多种实验方法，包括荧光显微镜、凝胶电泳和微尺度热泳动分析（MST）。这些实验显示，N蛋白能够显著促进单链RNA（ssRNA）和双链RNA（dsRNA）的杂交过程，且其对dsRNA的结合能力高于对ssRNA。此外，研究人员还测试了N蛋白对双链RNA的替代能力，即在存在完美匹配的RNA的情况下，N蛋白能够有效促进错配RNA的替换，表明其具有识别并纠正错误RNA结构的能力。

研究还发现，不同病毒变种的N蛋白在伴侣活性上存在差异。例如，与武汉株N蛋白相比，Omicron BA.5变种的N蛋白伴侣活性明显降低。然而，当研究人员通过模拟细胞磷酸化状态，即通过将丝氨酸或苏氨酸替换为天冬氨酸，来改变N蛋白的电荷分布时，Omicron BA.5 N蛋白的伴侣活性得以恢复。这表明，N蛋白的伴侣活性受到磷酸化状态的调控，而磷酸化可能是病毒感染和复制过程中的一种重要调控机制。这一发现强调了翻译后修饰在病毒RNA结构动态调控中的复杂作用，并为未来的抗病毒治疗提供了新的思路。

进一步研究还表明，N蛋白的伴侣活性并非完全依赖于其与RNA的结合能力。例如，某些抑制剂可以有效阻断N蛋白介导的液-液相分离（LLPS），但对RNA伴侣活性的影响却微乎其微。这说明，尽管LLPS在病毒复制和基因表达中发挥重要作用，但RNA伴侣活性可能是N蛋白执行其多种功能的独立机制。此外，研究人员还发现，离子强度的变化会影响N蛋白的伴侣活性。当盐浓度超过一定阈值时，N蛋白的伴侣活性会受到抑制，这提示了RNA伴侣过程可能受到环境条件的调控。

值得注意的是，N蛋白的结构域和IDRs之间存在复杂的相互作用。例如，RBD和CTD的结合可能受到IDR1和IDR3的影响，而IDR2则在伴侣活性中扮演核心角色。尽管IDR1和IDR3在一定程度上参与伴侣机制，但它们的缺失并未显著影响N蛋白的伴侣活性。这说明，IDR2可能是主要的伴侣活性区域，而其他IDRs可能起到辅助作用。同时，N蛋白的磷酸化状态对伴侣活性的影响具有显著的变种特异性。武汉株N蛋白在磷酸化后仍能保持其伴侣活性，而Omicron BA.5 N蛋白的伴侣活性在模拟磷酸化后得以恢复，这表明磷酸化可能在病毒生命周期中具有特定的调控作用。

这些发现不仅加深了我们对SARS-CoV-2 N蛋白功能的理解，还揭示了其在病毒复制和传播中的潜在作用。N蛋白的伴侣活性可能与其促进RNA杂交和结构重组的能力有关，这有助于病毒在宿主细胞内高效地复制和组装。此外，N蛋白的磷酸化可能影响其与其他宿主蛋白的相互作用，如RNA解旋酶DDX1，从而间接调控病毒的复制和传播能力。研究还指出，N蛋白的某些突变可能与其伴侣活性的降低相关，这可能影响病毒的感染效率和传播能力。

从更广泛的角度来看，N蛋白的RNA伴侣功能可能在RNA病毒中具有普遍意义。许多RNA病毒都依赖类似的伴侣蛋白来调控其基因组的结构，而这些伴侣蛋白通常具备非特异性结合RNA的能力，并且依赖IDRs进行动态调控。SARS-CoV-2的N蛋白不仅具备这些特征，还通过磷酸化状态的调控实现更精细的功能调节。这种调控机制可能成为未来抗病毒药物开发的新靶点，特别是针对RNA伴侣功能的抑制剂。

在实验方法方面，研究人员采用了一系列先进的技术手段，包括纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）、微尺度热泳动分析（MST）和电泳迁移率改变分析（EMSA）。这些方法能够准确地评估N蛋白的结构稳定性、RNA结合能力以及伴侣活性。此外，研究人员还进行了液-液相分离实验，以研究N蛋白在RNA组织中的作用。通过这些实验，他们能够更全面地了解N蛋白在病毒生命周期中的功能多样性。

综上所述，SARS-CoV-2 N蛋白不仅是一种RNA包装蛋白，还具有RNA伴侣活性。这种伴侣活性可能与其促进RNA杂交、稳定结构以及调控病毒复制相关。研究还发现，Omicron BA.5变种的N蛋白伴侣活性显著降低，但通过模拟其磷酸化状态，这一活性可以被恢复。这一发现为理解病毒变异对功能的影响提供了新的视角，并为开发针对RNA伴侣机制的抗病毒策略提供了理论依据。此外，研究还强调了RNA伴侣蛋白在病毒复制和宿主细胞调控中的重要性，以及翻译后修饰在其中的调控作用。这些发现不仅有助于我们更深入地理解SARS-CoV-2的生物学特性，还可能为其他RNA病毒的研究提供参考。