冬季活跃的蜘蛛（Clubiona）拥有一种超活性的抗冻蛋白，这种蛋白具有独特的β-螺旋结构

《The FEBS Journal》：Winter-active spiders (Clubiona) have a hyperactive antifreeze protein with a unique beta-solenoid fold

蜘蛛是果园害虫的重要天敌，其中Clubiona属蜘蛛在冬季仍保持活跃，因其能产生抗冻蛋白（AFPs），通过结合冰晶表面抑制冰晶生长。该研究从捷克梨园采集的Clubiona蜘蛛中分离出两种约30 kDa的AFP异构体，通过冰亲和纯化（IAP）和质谱分析（LC-MSMS、MALDI-TOF MS）证实其结构为独特的β-螺旋单体，具有平的冰结合表面（IBS）。尽管与甲虫、蛾类的AFP结构相似，但序列无同源性，表明趋同进化。代谢组学测序显示样本包含至少三种Clubiona物种，且其AFP基因在物种间分布不均。重组表达验证了纯化AFP的活性（热滞后的温度达4.3°C）。分子动力学模拟显示IBS由重复的Thr、Ser和Ala构成，与已知 AFP结构一致，但具有独特的序列特征和糖基化修饰。该研究为天敌昆虫的冬季活动机制及抗冻蛋白的进化提供了新证据。

　　蜘蛛在果园生态系统中扮演着重要的角色，作为害虫的天然天敌，它们在冬季依然保持活跃，而其他许多害虫捕食者则在低温下进入休眠状态。这一现象表明，蜘蛛可能具备某些特殊的适应机制，使其能够在严寒环境中维持生命活动。研究发现，某些蜘蛛种类能够产生抗冻蛋白（AFPs），这些蛋白质在低温条件下可以阻止冰晶的生长，从而防止细胞受损。特别是属于“Clubiona”属的蜘蛛，在冬季仍能主动捕食，这对果园害虫的控制具有重要意义。

在本研究中，科学家们从捷克共和国的一个梨果园中采集了“Clubiona”属的蜘蛛，并在12月和2月的低温条件下进行实验。这些蜘蛛在冬季依然活跃，表明其体内可能含有能够抵御低温的特殊分子。为了研究这些AFPs，研究人员通过五次连续的冰亲和纯化（IAP）过程，成功地从蜘蛛组织中分离出一组约30千道尔顿（kDa）的蛋白异构体。随后，利用串联质谱（LC-MSMS）技术对这些AFPs进行了序列分析，并通过Illumina宏转录组技术获得了对应的转录序列。这些AFPs在GenBank蛋白数据库中没有已知的同源蛋白，这说明它们可能是独立进化形成的。AlphaFold2蛋白建模结果显示，这些蜘蛛AFPs形成了一个前所未见的β-溶索结构，其表面布满了富含苏氨酸（Thr）的阵列。虽然这些结构特征与某些甲虫和蛾类的β-溶索型AFPs相似，但它们在序列上并不同源，这表明这些蛋白在结构和功能上存在趋同进化的现象。

“Clubiona”属蜘蛛在冬季表现出显著的抗冻活性，其热滞后（TH）值可达4.3°C。这表明这些蜘蛛的AFPs在低温下具有高度的冰晶结合能力，能够有效防止冰晶的进一步生长。研究人员发现，当样本被稀释20倍时，TH活性仅下降了一半，说明这些AFPs在稀释条件下仍能保持较高的功能活性。通过冰亲和纯化，研究人员进一步提高了AFP的纯度，并成功地在第五次纯化后获得了高达5.6°C的TH活性。这种高活性表明，这些蜘蛛AFPs可能具有非常强的冰晶抑制能力，使其能够在低温环境下持续捕食。

进一步的质谱分析显示，这些AFPs存在多种异构体，其中一些异构体可能经过了糖基化修饰。MALDI-TOF MS结果表明，这些蛋白质的分子量分布较为广泛，这可能是由于糖基化或其他翻译后修饰导致的。通过LC-MSMS，研究人员发现了多个不同的肽段序列，其中一些具有较高的重复性，例如苏氨酸、丝氨酸和丙氨酸等小分子残基在冰结合表面（IBS）上占据主导地位。这种结构特征在其他昆虫的AFPs中也有所体现，但蜘蛛AFPs的序列与这些昆虫的AFPs并不相似，这进一步支持了趋同进化的观点。

在对这些AFPs的结构进行建模时，研究人员发现，尽管AlphaFold2的初始建模结果存在一定的不确定性，但通过引入自定义的多序列比对（MSA）后，模型的准确性得到了显著提升。研究显示，这些蜘蛛AFPs的β-溶索结构具有较大的平面区域，这可能是其高活性的关键。此外，这些结构的排列方式与某些昆虫的AFPs相似，但蜘蛛的AFPs在进化过程中可能独立发展出了类似的冰结合能力。研究还发现，这些蛋白可能通过形成八个重复的螺旋结构来增强其结合冰晶的能力，其中一些重复区域具有高度保守的残基，如苏氨酸、甘氨酸和异亮氨酸等。

在功能研究方面，研究人员通过表达重组蛋白进一步验证了这些AFPs的活性。将Isoform 1在大肠杆菌中表达后，经过一系列纯化步骤，TH活性得到了显著提高。这表明，这些蜘蛛AFPs不仅具有天然的抗冻能力，而且在人工表达条件下也能保持其功能特性。此外，通过观察冰晶的形态变化，研究人员发现，这些AFPs能够有效抑制冰晶的生长，使冰晶在低温下形成特定的六边形结构。这种冰晶形态的变化与某些昆虫的AFPs相似，进一步支持了趋同进化的结论。

在生态学意义上，这些蜘蛛AFPs的发现具有重要意义。由于冬季活跃的蜘蛛能够持续捕食害虫，如梨小绿叶蝉，这有助于降低害虫种群密度，从而减少对果园作物的侵害。此外，研究还表明，蜘蛛AFPs可能对生物防治策略具有潜在的应用价值。通过提供适合蜘蛛栖息的微生境，如树干包裹物，可以进一步增强这些蜘蛛的捕食能力，从而减少对化学农药的依赖，提高生态系统的稳定性。

本研究通过多种实验手段，如冰亲和纯化、质谱分析和蛋白建模，揭示了“Clubiona”属蜘蛛AFPs的结构和功能特性。研究结果表明，这些AFPs不仅具有独特的结构特征，还可能通过独立的进化路径获得了类似的冰结合能力。此外，研究还发现，这些AFPs在序列和结构上与其他昆虫的AFPs存在差异，但它们在功能上却表现出高度的相似性。这种现象为理解抗冻蛋白的进化机制提供了新的视角，并可能对未来的生物防治技术产生重要影响。

在研究过程中，科学家们还发现，这些AFPs可能经历了复杂的翻译后修饰，包括糖基化。这种修饰可能对蛋白质的稳定性或冰结合能力产生影响。例如，糖基化可能增加了蛋白质的分子量，使其在冰亲和纯化过程中更易被富集。此外，糖基化的存在也可能影响蛋白质的构象，从而增强其与冰晶的相互作用。研究还表明，不同“Clubiona”属的蜘蛛可能具有不同的AFPs异构体，这可能与它们的生态位和生存策略有关。

通过比较不同物种的AFPs序列，研究人员发现，这些蜘蛛AFPs在基因组中并未广泛存在，而是在特定的物种中以不同的形式出现。例如，某些“Clubiona”属的蜘蛛可能在冬季表现出较高的AFPs表达水平，而在夏季则可能下调其表达。这种季节性表达模式可能与环境温度的变化有关，同时也说明了这些蛋白质在不同生活阶段的功能差异。此外，研究还发现，这些AFPs在某些情况下可能具有较高的序列多样性，这可能是为了适应不同的冰结合需求。

综上所述，本研究揭示了“Clubiona”属蜘蛛在冬季保持活跃的分子机制，表明它们可能通过抗冻蛋白的结构和功能特性实现了对低温环境的适应。这些蛋白的发现不仅拓展了我们对抗冻蛋白多样性的认识，也为未来的生态调控和生物防治策略提供了新的思路。此外，研究还强调了趋同进化在蛋白质功能获取中的重要性，即不同物种可能通过不同的进化路径获得相似的功能特性。这一发现对于理解蛋白质的适应性和进化机制具有重要的科学价值。