植物产生的封装蛋白能够展示非伤寒型沙门氏菌（Salmonella enterica）的抗原，并组装成马赛克状的纳米颗粒

《The FEBS Journal》：Plant-produced encapsulin displays non-typhoidal Salmonella enterica antigens and assembles into mosaic nanoparticles

沙门氏菌FepA蛋白的表位通过植物表达的encapsulin纳米颗粒展示，验证了其在 chloroplast 和 cytosol 中的高效组装及多表位共组装能力，为开发口服疫苗提供新策略。

　　食品源性疾病对公共健康和经济造成了重大影响。非伤寒沙门氏菌（Salmonella）是与受污染禽类产品相关的一种常见致病因子，被认为是人类食物中毒的主要原因之一。沙门氏菌感染禽类的控制措施中，疫苗的使用被认为是最重要的手段之一。然而，现有的疫苗存在一些局限性，例如安全性问题、免疫原性不足以及接种方式不够高效。因此，迫切需要开发更加有效的沙门氏菌疫苗。

为了寻找更有效的疫苗候选物，研究者关注了沙门氏菌的外膜蛋白。其中，铁离子载体受体（FepA）因其在铁获取过程中的关键作用而引起了广泛关注。FepA是一种由沙门氏菌产生的外膜蛋白，具有β桶结构，可以跨越外膜，并且包含多个外露的环状结构，这些结构可能成为疫苗抗原的插入位点。由于这些环状结构位于细菌表面，且能够被免疫系统识别，因此，抗体对这些环状结构的识别可能抑制细菌的铁获取过程，从而阻止其在宿主中的繁殖和致病。

近年来，蛋白质纳米颗粒作为一种新型的疫苗抗原展示平台，逐渐受到关注。这些纳米颗粒由多个亚基组成，能够自我组装为稳定的结构，并且可以在其表面以高度有序和重复的方式展示抗原表位，这与天然病原体的结构相似。这种特性使得它们比单体抗原具有更强的免疫原性，有助于激发宿主的免疫应答。此外，蛋白质纳米颗粒还具有类佐剂的特性，可以促进更强大的免疫反应，并且可以有效地将抗原呈现给黏膜免疫系统，这对于通过黏膜进入宿主的病原体如沙门氏菌尤为重要。

在本研究中，我们首次尝试在植物中表达封装蛋白（encapsulin），这是一种由嗜热菌Thermotoga maritima产生的蛋白质纳米颗粒。封装蛋白由60个相同的31千道尔顿（kDa）亚基组成，能够自我组装为直径约25纳米的二十面体纳米笼。通过在封装蛋白的特定位置插入抗原表位，可以利用其作为疫苗载体，提高疫苗的效率和可操作性。我们选择将FepA的五个外膜环状结构作为抗原表位，因为它们在沙门氏菌中高度保守，并且具有较高的抗原性。这些环状结构包括L2、L3、L4、L8和L10，分别对应不同的表位。

为了在植物中表达这些融合蛋白，我们设计了两种不同的表达载体，一种用于靶向叶绿体，另一种用于靶向细胞质。通过利用瞬时表达技术，我们成功地在Nicotiana benthamiana（烟草）叶片中表达了封装蛋白和五个FepA-封装蛋白融合蛋白。结果显示，靶向叶绿体的融合蛋白积累水平显著高于靶向细胞质的蛋白，最高可达0.7毫克/克鲜重（mg·g?1 FW）。此外，我们还发现这些融合蛋白能够自我组装为纳米颗粒，并且通过透射电镜（TEM）和免疫金标记技术验证了FepA表位的表面展示。这些结果表明，封装蛋白在植物中不仅能够高效表达，还能形成具有高度抗原展示能力的纳米颗粒。

为了进一步提高疫苗的表达效率，我们还尝试在Nicotiana tabacum（烟草）中通过转基因方式表达封装蛋白和E-L2融合蛋白。与瞬时表达相比，转基因表达使得蛋白的积累水平提高了近五倍，达到2.4毫克/克鲜重。这表明，封装蛋白在植物中的表达不仅具有可行性，而且在某些情况下，其产量可以显著提高。此外，我们还发现，即使在转基因烟草中，E-L2的表面展示仍然可以被检测到，这表明无论是在叶绿体还是细胞质中，封装蛋白都能有效展示抗原表位。

为了提高疫苗的多价性和有效性，我们还尝试将不同表位的封装蛋白亚基共表达，以形成所谓的“马赛克”纳米颗粒。这些纳米颗粒可以在植物细胞中自我组装，并且可以同时展示多个不同的抗原表位。这一策略可以避免单独表达多个融合蛋白所带来的高成本和复杂性。通过免疫金标记技术，我们成功地确认了不同表位在纳米颗粒表面的共展示，这为开发多价疫苗提供了新的思路。

然而，植物表达系统也存在一些挑战。例如，一些FepA表位的融合蛋白在细胞质中表达时，其积累水平较低，甚至无法检测到。这可能是由于某些表位对封装蛋白的稳定性产生了负面影响。此外，植物中某些表达系统的局限性，如缺乏复杂的翻译后修饰能力，可能影响抗原的表达和展示。因此，在设计融合蛋白时，需要充分考虑这些因素，以确保抗原的有效性和疫苗的整体效果。

在植物表达系统中，转基因方法可以提供更稳定的表达平台。由于叶绿体基因组具有高拷贝数和母系遗传特性，可以避免基因沉默的问题，并且可以实现更高的蛋白产量。然而，转基因植物的表达也伴随着一些副作用，如生长受限。在本研究中，转基因烟草的生长速度略低于野生型烟草，这可能与转基因对植物生理的干扰有关。尽管如此，这种生长受限的程度并不影响其作为疫苗载体的潜力，因为其主要目标是生产足够的抗原蛋白。

在疫苗的应用方面，植物表达系统提供了许多优势。首先，植物易于种植和管理，成本较低，这使得大规模生产成为可能。其次，通过将疫苗添加到动物饲料中，可以实现口服接种，从而避免了注射所带来的风险和不便。这种口服接种方式也减少了疫苗生产中的复杂蛋白纯化步骤，从而降低了生产成本。此外，口服疫苗可以直接作用于黏膜组织，提高分泌型免疫球蛋白A（sIgA）的水平，这对于沙门氏菌等通过黏膜进入宿主的病原体尤为重要。

然而，口服疫苗仍然面临一些挑战。例如，疫苗必须在胃肠道的酸性环境和高酶活性中保持稳定，以便能够被有效运输到肠道黏膜并激活抗原呈递细胞。因此，疫苗的配方需要经过优化，以确保其在胃肠道中的稳定性。此外，口服疫苗的剂量控制也较为复杂，因为动物之间的摄入量可能不同，而人类疫苗则需要严格的剂量管理。尽管如此，已有研究表明，即使在较宽的剂量范围内，口服疫苗仍然可以诱导有效的免疫应答，例如针对猪带绦虫（Taenia solium）的口服木瓜疫苗，在不同剂量下均能有效诱导免疫反应。

本研究不仅验证了封装蛋白在植物中的表达和组装能力，还展示了其在疫苗开发中的潜力。通过在植物中表达FepA-封装蛋白融合蛋白，我们可以利用其高效的表达和组装能力，生产出具有多价性和高免疫原性的疫苗。此外，通过共表达不同表位的封装蛋白亚基，我们还实现了“马赛克”纳米颗粒的形成，这为开发更全面的疫苗提供了新的思路。虽然这种方法可能导致纳米颗粒的组成较为随机，但在实际应用中，只要确保所有表位都被表达，就可以实现有效的免疫应答。

总的来说，本研究展示了封装蛋白在植物表达系统中的巨大潜力。通过将FepA的抗原表位插入到封装蛋白的特定位置，我们成功地构建了能够自我组装并展示抗原表位的纳米颗粒。这些纳米颗粒不仅在植物中能够高效表达，而且在转基因烟草中还能实现更高的产量。这一发现为开发基于植物表达的沙门氏菌疫苗提供了重要的基础，也为未来的疫苗研究提供了新的方向。尽管仍然需要进一步研究疫苗的实际免疫效果，但本研究已经证明了封装蛋白在疫苗设计中的可行性和有效性。