基于干湿法的哺乳动物细胞培养水动力应力优化策略

《Engineering in Life Sciences》：Scale-Up Strategy Focused on Hydrodynamic Stress for Mammalian Cell Culture Established by a Dry-Wet Approach

本研究通过开发小规模降维模型（SSDM）和计算流体动力学（CFD）模拟，揭示了不同规模和配置生物反应器（BR）中平均剪切应力与CHO-K1细胞产量相关性，确定剪切应力阈值（3.0-3.4 Pa）导致≥10%的抗体滴度下降。提出利用平均剪切应力作为跨规模BR参数匹配的指标，并证实细胞系对剪切敏感性的差异，为规模化生产中的BR切换和克隆筛选提供理论依据。

　　在现代生物制药领域，许多重组蛋白药物的生产依赖于哺乳动物细胞，尤其是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，在搅拌式生物反应器（BR）中进行批次或连续培养。尽管细胞培养规模扩大的策略已经被广泛研究，但在不同配置的生物反应器之间进行规模调整和切换时，维持一致的培养性能仍然是一个挑战。这一问题的根源在于，目前用于确定操作参数的实证相关性通常只适用于相似的生物反应器，并且在小规模的缩放模型（SSDM）中，往往难以准确评估细胞对制造规模生物反应器剪切环境的敏感性。因此，研究如何在不同规模和配置的生物反应器中准确模拟剪切环境，是实现高效、稳定规模扩大的关键。

在本研究中，我们关注生物反应器中的流体动力学应力，特别是搅拌所引起的剪切力。通过开发一种能够生成高剪切环境而不引发不良二次效应（如涡旋形成和严重的气体滞留）的SSDM，我们旨在为细胞培养的规模调整提供一个可靠的工具。研究使用了多种规模和配置的内部生物反应器，进行了CHO-K1细胞的补料批次培养，并通过计算流体力学（CFD）对这些反应器的剪切环境进行了表征。通过多变量分析，我们发现平均剪切应力与培养性能指标（如产物滴度下降）之间存在良好的相关性。此外，我们还评估了不同细胞系对剪切应力的敏感性，发现这种敏感性因细胞系而异，因此在克隆选择和工艺开发阶段，评估细胞对剪切的耐受性是降低工艺风险的重要步骤。

剪切应力通常被认为会对细胞造成破坏，尤其是对悬浮培养中的哺乳动物细胞。然而，近年来的研究发现，剪切应力的非致命性影响（如产量下降）同样值得关注。通过CFD模拟，我们能够量化不同规模和类型反应器中的剪切应力、能量耗散率（EDR）和流动速度等参数。CFD的可视化能力使得我们能够更全面地理解细胞在不同剪切条件下的反应，从而为优化操作条件提供了依据。例如，一些研究表明，基于CFD模拟的搅拌速率和气体传递效率的调整，有助于实现不同规模反应器之间的有效转移。

在本研究中，我们特别关注如何在不引发涡旋或气体滞留的前提下，生成高剪切应力的环境。为此，我们设计并测试了一种3升的玻璃反应器（GBR-3），该反应器配备了特定的搅拌桨和固定叶片结构，以在较低的搅拌速率下实现较高的平均剪切应力。通过CFD分析，我们发现这种设计在制造规模的反应器中也能模拟出相似的剪切环境，从而避免了高搅拌速率可能导致的不良后果，如氧气和二氧化碳浓度的不稳定。此外，我们还通过实际细胞培养实验验证了该反应器在不同搅拌速率下的性能表现，发现较高的平均剪切应力会导致细胞存活率、细胞大小和产物滴度的下降，而这些影响在低剪切条件下则不明显。

通过对比不同规模反应器的培养性能，我们发现平均剪切应力是一个能够有效反映细胞在不同操作条件下所承受的剪切环境的关键参数。与之前研究中发现的最大剪切应力与细胞性能相关性较弱的结果不同，我们发现平均剪切应力与产物滴度之间的相关性显著。这一发现表明，平均剪切应力可能是更适用于不同反应器规模和配置的通用指标。此外，我们还发现不同细胞系对剪切应力的敏感性存在差异，因此在克隆选择阶段，对细胞的剪切耐受性进行评估是确保规模扩大的关键策略之一。

在实际应用中，我们发现一些细胞系在较低的平均剪切应力条件下仍能保持较高的产物滴度，而在较高的剪切条件下则会出现明显的产量下降。例如，在平均剪切应力为2.9帕的条件下，部分mAb A表达细胞系的滴度下降超过10%，而在更高的5.2帕条件下，这一下降幅度进一步增加。相比之下，部分Fab A表达细胞系在相同剪切条件下仅出现轻微的滴度下降。这些结果强调了在细胞培养工艺中，选择具有较高剪切耐受性的细胞系的重要性。同时，这也为不同规模和类型反应器之间的规模转移提供了理论依据，即通过控制平均剪切应力，可以在不同反应器之间实现一致的细胞生长和产物产量。

本研究的结果不仅为生物制药行业提供了新的工具，还为未来的研究方向指明了方向。例如，如何进一步分析平均剪切应力对产品质量（如聚集物和电荷变异体）的影响，以及更深入地理解剪切应力对细胞大小、存活率和产物滴度的具体作用机制，都是值得进一步探索的领域。此外，研究还表明，尽管CFD在实验室和制造规模反应器的表征中已被广泛应用，但其在不同规模和配置的反应器之间进行比较时，仍需进一步优化模型参数，以确保结果的准确性和可推广性。

总体而言，本研究通过结合CFD模拟和实际细胞培养实验，揭示了平均剪切应力在不同反应器配置中的重要性，并成功开发了一种能够有效模拟制造规模反应器剪切环境的小规模缩放模型。这一模型为细胞培养工艺的优化和规模转移提供了重要的支持，同时强调了在工艺开发早期评估细胞对剪切的敏感性对于成功实现规模扩大的必要性。未来，随着生物反应器设计的不断进步和CFD技术的进一步发展，这些方法有望在更大范围内应用于细胞培养工艺的标准化和优化。