降钙素基因相关肽通过GTP酶Rap1抑制巨噬细胞的迁移和分化

《Journal of Biological Chemistry》：Calcitonin gene-related peptide inhibits macrophage migration and differentiation via the GTPase Rap1

根吸收是牙齿再植术后常见并发症，本研究发现CGRP通过调控巨噬细胞迁移和成牙骨质细胞分化抑制根吸收，其机制涉及RAMP1受体介导的Rap1/PI3K/AKT信号通路。

　　牙齿再植术是一项重要的临床治疗方法，用于在传统治疗手段不可行或不适用的情况下保留自然牙齿。然而，根吸收是牙齿再植术中最常见的并发症之一，直接影响手术的成功率。根吸收主要由破骨细胞介导，而破骨细胞来源于骨髓中的单核/巨噬细胞前体。这些细胞在炎症环境中被激活，释放溶骨酶，从而导致牙根表面的逐渐降解。本研究探讨了钙基因相关肽（CGRP）在牙齿再植术后对根吸收的影响及其作用机制，为解决这一临床问题提供了新的思路。

在牙齿再植术后，炎症反应会促进循环单核细胞向牙周韧带迁移并分化为巨噬细胞，最终转化为破骨细胞，加速牙齿的吸收。研究表明，巨噬细胞的极化状态（M1/M2）与根吸收的严重程度密切相关，其中促炎性巨噬细胞在正畸力的影响下发挥关键作用。此外，Zeng等人的研究发现，在根吸收部位附近，系统性单核细胞减少，但局部单核细胞数量增加，并与TRAP阳性破骨细胞共定位。这表明巨噬细胞的招募和极化在破骨细胞分化和炎症性根吸收中起着至关重要的作用。

值得注意的是，牙周微环境具有丰富的神经分布和血管供应，其中三叉神经和自主神经对牙周组织的调控起着重要作用。这些神经元能够分泌多种神经肽，包括物质P（SP）、CGRP和生长抑素，这些物质对骨组织和免疫细胞具有直接作用。CGRP在骨组织中高度表达，能够促进成骨作用并抑制破骨细胞的吸收，从而维持骨稳态。此外，CGRP还通过调节免疫反应和促进血管生成来参与组织修复。已有研究表明，CGRP能够抑制RANKL诱导的NF-κB激活，从而抑制破骨细胞的形成。同时，CGRP还具有促进成骨分化、防止脂多糖（LPS）诱导的成骨细胞凋亡以及促进间质干细胞迁移的作用，支持其在牙周炎症和牙槽骨缺陷等炎症条件下的再生功能。特别是在创伤后，CGRP在牙周组织中的表达上调，提示其可能在局部骨-免疫调控中发挥重要作用。

尽管CGRP在骨组织中的作用已有所了解，但其是否直接调节巨噬细胞迁移以影响破骨细胞生成和根吸收仍不清楚。本研究旨在通过体外实验和动物模型，阐明CGRP在巨噬细胞招募、极化及破骨细胞生成中的作用，并进一步探讨其是否通过Rap1/PI3K/AKT信号通路发挥作用。研究结果显示，CGRP能够显著抑制巨噬细胞迁移和破骨细胞分化，并减少再植后牙齿的根吸收。这表明CGRP可能成为治疗根吸收的潜在靶点。

在体外实验中，我们使用划痕实验和跨膜迁移实验评估了CGRP对巨噬细胞迁移的影响。结果显示，CGRP处理组的伤口愈合百分比显著低于对照组，表明其抑制了巨噬细胞的迁移能力。跨膜迁移实验也显示，CGRP能够有效减少巨噬细胞从上室向下的迁移。这些结果表明，CGRP对巨噬细胞迁移具有显著的抑制作用。进一步的免疫荧光染色和形态学分析显示，CGRP处理组的巨噬细胞形态发生变化，细胞极性降低，细胞突起减少，表明其影响了细胞迁移所需的结构变化。

在细胞迁移的分子机制方面，我们通过RNA测序分析了CGRP对巨噬细胞迁移相关基因表达的影响。结果表明，CGRP处理显著改变了多个迁移相关基因的表达模式，包括Cxcl10、Ccl5、Itgb2l和S100a9等。同时，我们还观察到Postn、Ogn、Septin7和Fgf7等基因的表达增加，这些基因与成骨细胞分化或细胞迁移的抑制有关。基因集富集分析（GSEA）进一步支持了这些发现，显示CGRP处理显著富集了与细胞迁移抑制相关的基因集，以及Rap1和PI3K/AKT信号通路。这些结果表明，CGRP通过调节这些信号通路，对巨噬细胞迁移和破骨细胞生成具有抑制作用。

为了进一步验证Rap1/PI3K/AKT信号通路在CGRP作用中的重要性，我们进行了Rap1的沉默实验。结果显示，Rap1的沉默能够逆转CGRP对巨噬细胞迁移的抑制作用，表明Rap1在这一过程中起着关键的调控作用。此外，使用PI3K/AKT抑制剂进一步抑制了CGRP处理后的巨噬细胞迁移，支持了Rap1和PI3K/AKT信号通路的协同作用。这些发现表明，CGRP通过激活Rap1并抑制PI3K/AKT信号通路，显著减少了巨噬细胞的迁移能力，从而抑制了破骨细胞的形成和根吸收的发生。

在体内实验中，我们使用了大鼠牙齿再植模型来评估CGRP的治疗效果。结果显示，CGRP处理组的牙根和牙槽骨吸收程度显著低于对照组。此外，CGRP处理组的牙周组织表现出更完整的胶原纤维结构，并且TRAP阳性破骨细胞的数量显著减少。这些结果进一步验证了CGRP在抑制根吸收中的作用，并提示其可能通过调控巨噬细胞迁移和破骨细胞分化来实现这一效果。

综上所述，本研究发现CGRP能够通过Rap1/PI3K/AKT信号通路显著抑制巨噬细胞迁移和破骨细胞分化，从而减少牙齿再植术后的根吸收。这一机制可能为未来治疗根吸收提供新的策略。然而，研究仍存在一些局限性，例如体内实验未能完全证实CGRP对根吸收的直接作用，以及CGRP拮抗剂BIBN4096在无CGRP刺激的情况下对细胞形态和信号通路的轻微影响。未来的研究可以利用转基因或腺相关病毒（AAV）动物模型，以更明确地揭示CGRP信号通路与根吸收之间的因果关系。此外，使用基因敲除技术进一步验证CGRP受体的特异性，有助于更全面地理解其作用机制。