PIONEER：一种用于基于合成生物学的基因编码蛋白调节因子筛选的细胞质展示平台

《Journal of Biological Chemistry》：PIONEER: A Periplasmic Display Platform for Synthetic Biology-Based Screening of Genetically Encoded Protein Regulators

PIONEER是一种模块化酵母周质显示平台，用于直接检测膜蛋白功能。通过优化分泌信号（αPrePro）和显示支架（Ccw14），有效保留配体并激活自分泌信号。该平台成功应用于人类GPCR的表面表达检测、配体功能谱绘制及纳米抗体调节作用分析，展示了在药物发现和基础研究中的潜力，并与AI设计结合实现功能导向筛选。

　　### 酵母细胞周质展示的潜力与进展

酵母细胞周质展示技术是一种具有前景但尚未充分开发的用于筛选和研究遗传编码生物分子的方法。这项技术能够将肽、蛋白质和纳米抗体定位于酵母细胞膜附近的周质空间，从而直接评估膜蛋白的功能。通过优化分泌信号和展示支架，该系统确保了配体的稳定保留和强效的自分泌信号传递。与传统的结合分析不同，该系统能够通过信号响应来评估配体活性，这标志着向功能优先的筛选方法迈出关键一步。

在人类G蛋白偶联受体（GPCRs）的应用中，该系统能够检测膜表面表达，分析配体激活的信号特征，并分类针对GPCR的纳米抗体调节剂，包括拮抗剂和构象稳定剂。此外，它还能区分内体（intrabodies）的功能效应和伴侣蛋白活性。尽管该方法最初在GPCRs上得到验证，但其适应性广泛，适用于各种膜蛋白和可溶性蛋白目标。随着人工智能驱动的分子设计技术的不断进步，该平台提供了一种可扩展的方法，能够将预测的序列与结构与其生物功能联系起来。

### 酵母细胞周质展示的原理与优势

酵母细胞周质展示技术在概念上是细胞表面展示的逆过程，其应用仍处于初步阶段。该方法将重组蛋白定位在细胞膜与细胞壁之间的受限周质空间，为研究涉及跨膜蛋白的应用提供了独特的优势。例如，通过将蛋白与类似invertase（Suc2p）或工程化Flo1p变体等锚定蛋白融合，这些蛋白被分泌到细胞质中但保留在膜附近，从而直接与膜嵌入的靶蛋白相互作用。

与细胞表面展示相比，细胞周质展示技术不仅限于识别结合伙伴，还能实现功能选择。这意味着该方法可以用于发现不仅能够结合，还能通过激动、抑制或变构调节来调节跨膜蛋白活性的遗传编码肽和蛋白质。由于每个配体在酵母基因组或质粒上具有唯一的条形码，配体的功能与序列之间存在一一对应关系，这简化了后续筛选应用和识别过程。

### 选择有效的展示蛋白

为了优化细胞周质展示，我们开发了一个基于酵母的模块化平台，以人类GPCR信号为验证案例。该平台由三个关键组件组成：一种高效的分泌信号，一种遗传编码的蛋白配体，以及一种能够将配体保留在周质空间并使其在细胞壁上呈现的展示蛋白。我们对多个候选展示蛋白进行了评估，包括Ccw14、Sed1、Suc2和Flo5，这些蛋白表现出不同的定位模式和展示效率。其中，Ccw14显示出最佳的展示效果，能够有效驱动GPCR的激活，显示出最高的相对评分，反映了总mTq2输出和信号强度。相比之下，Sed1在CXCR4上表现良好，但在SSTR5上仅达到Ccw14活性的约30%。Suc2的展示效果较差，其激活能力与Flo42对照相当，而低于Ccw14。这些结果确立了Ccw14作为细胞周质配体展示的最佳支架。

### 选择最优的分泌信号肽

在确定了Ccw14作为最佳展示蛋白后，我们进一步优化了负责配体分泌和信号传递的分泌信号肽。我们测试了多种分泌信号，包括αPrePro和Ost1。αPrePro是一种由αPre和Pro区域组成的双功能信号肽，能够引导蛋白质进入内质网并进行酶促处理和高尔基体运输。相比之下，Ost1信号促进蛋白质在粗面内质网中的共翻译转运，通常产生更高效的分泌进入。通过测试不同分泌信号的输出和效率，我们发现αPrePro在所有测试的分泌信号中表现最佳，能够提供最强的GPCR激活，其次是αPreProV4和Ost1αPro。基于这些结果，我们选择了αPrePro作为最优的分泌信号肽，以支持Ccw14展示平台的高效运作。

### PIONEER平台在检测膜表面表达中的应用

在建立PIONEER平台后，我们进一步展示了其在不同应用中的效用。首先，我们采用了一种分割荧光素酶系统来检测膜表面蛋白的表达情况。该系统利用两个片段：LgBiT，一种约18 kDa的非活性荧光素酶，以及HiBiT，一种11个氨基酸的肽，能够与LgBiT结合以恢复活性。我们通过将GPCR的细胞外N端标记为HiBiT，并使用αPrePro-LgBiT-Ccw14结构在周质空间展示LgBiT，实现了荧光素酶的重组和荧光信号的产生。结果显示，当HiBiT与LgBiT在周质空间相遇时，能够重新构成荧光素酶并产生可检测的信号。

通过这种方法，我们能够检测到原生酵母GPCR Ste2和人类GPCR的表面表达情况。测试结果显示，只有在完整的PIONEER配置下，HiBiT才能与LgBiT在周质空间中结合，恢复荧光素酶活性并产生信号。这些结果不仅验证了该平台的兼容性，还表明LgBiT是一种适合与Ccw14融合的蛋白。

### PIONEER平台在检测GPCR自分泌激活中的应用

作为PIONEER平台的第二个应用，我们再次利用其检测CXCR4和SSTR5的自分泌激活。通过将αPrePro-配体-Ccw14展示结构与DCyFIR系统结合，我们能够评估GPCR与Gα的偶联情况。我们使用了包含所有可能的受体-Gα偶联组合的十种DCyFIR菌株，每种菌株表达一种人类-酵母Gα嵌合体。这些嵌合体覆盖了Gα的多个家族，包括Gi/o、Gq、Gs和G12/13，从而确保人类GPCR能够高效地偶联到酵母信号通路中。因此，DCyFIR系统支持持续激活、全面的药理学研究以及配体/药物筛选，并通过mTq2转录报告基因作为荧光读数。

通过测试不同配体的激活情况，我们发现SSTR5能够通过多个Gi/o家族成员信号，其中Gz产生最强的响应。同时，SSTR5还能偶联到Gq家族成员G15。CXCR4则通过Gi和Gt信号，其中Gi产生最高的激活。这些结果表明，PIONEER平台不仅具有鲁棒性和选择性，还适用于肽和蛋白质激动剂的评估。一个关键优势是，遗传编码的配体可以直接在酵母中通过质粒转化或CRISPR整合生产，无需外部合成或纯化。由于配体被保留在周质空间，每个受体都与一个配体配对，使得该系统非常适合高通量库筛选。

### PIONEER平台在检测GPCR信号调节中的应用

接下来，我们测试了纳米抗体调节剂与PIONEER系统的兼容性。纳米抗体是源自骆驼重链抗体的单结构抗体片段，能够在紧凑且稳定的构型下保持完整的抗原结合能力。它们的小尺寸和稳定性使得在微生物系统如酵母中高效生产成为可能，并能够接触到传统抗体难以接触的表位。纳米抗体广泛用于GPCR研究，以稳定特定受体构象，促进结构确定。此外，它们还作为构象生物传感器，用于检测和调节GPCR的激活状态。

我们推测，PIONEER系统能够实现纳米抗体与GPCR的结合，并通过信号传递来评估其功能。传统酵母表面展示将纳米抗体展示在细胞壁外，依赖于纯化的、珠状结合的GPCR，使得纳米抗体能够结合受体的任一侧面，而没有功能特异性，并且没有信号读数。相比之下，PIONEER在周质空间中表达和展示纳米抗体，将纳米抗体的结合直接与GPCR信号传递联系起来。这种配置使得纳米抗体能够选择性地结合受体的细胞外侧（外体）或细胞内侧（内体），从而提供空间控制和功能分辨率。

通过测试不同的纳米抗体，我们发现PIONEERed外体能够有效抑制AGTR1和CXCR4的激活。为了设置实验，我们将αPrePro-AGT-II和αPrePro-CXCL12a构建物置于半乳糖启动子下，以驱动诱导的激动剂生产。通过调节半乳糖浓度，我们生成了剂量反应曲线，以控制激动剂释放到周质空间的量。拮抗剂PIONEERed外体则被恒定表达，并与AGT-II和CXCL12a的诱导同时进行，确保受体同时暴露于激动剂和拮抗剂。由于配体释放和外体结合是同时进行的，该实验内在地测量了受体结合的竞争，使得PIONEERed纳米抗体介导的功能抑制可以直接量化。

我们测试了两种已开发的针对AGTR1的外体，AT118是一种亲和力不高的纳米抗体，而AT118i4则通过CDR1区域的两个突变实现了体外和体内竞争性拮抗。与之前的结果一致，AT118并未抑制AGTR1信号，但我们观察到剂量反应曲线向右偏移，这可能表明其具有较弱的抑制作用或负变构调节。而AT118i4则显著抑制了AGTR1信号，尽管在高激动剂浓度下未完全阻断受体激活。

在CXCR4的研究中，我们测试了三种外体，其中CA4139、238D2和238D4。CA4139和238D2需要展示才能抑制信号，而238D4则不需要。这表明238D4可能与CA4139和238D2相比具有更强的结合能力。然而，之前的研究所报告的CXCL12配体位移的EC50值、CXCR4-Gαqi5刺激的肌醇磷酸积累以及CXCR4-Gαi介导的cAMP报告基因活性表明，这些外体可能具有不同的结合亲和力或动力学特性。可能的解释包括238D4的解离速率较慢或其在PIONEER系统中的高产量和分泌效率。无论如何，这些结果表明，PIONEER平台在筛选和评估GPCR拮抗性纳米抗体方面具有重要的应用价值。

为了进一步验证PIONEERed外体的效用，我们还测试了展示是否是必要的。通过比较三种CXCR4外体（CA4139、238D2和238D4）在展示和非展示条件下的效果，我们发现CA4139和238D2需要展示才能抑制信号，而238D4则不需要。这可能意味着238D4的结合能力更强。然而，由于这些外体在之前的实验中表现出相似的EC50值，可能的解释包括其结合动力学或生产效率的不同。无论如何，这些结果表明，PIONEER平台对于捕捉纳米抗体-GPCR相互作用至关重要，无论这些相互作用涉及广泛的结合动力学和热力学特性。

### PIONEER平台在检测GPCR信号调节中的应用

作为PIONEER平台的最终应用，我们利用其能够产生纳米抗体，并将其展示为外体或保留为内体的能力，来研究GPCR的信号调节。内体在GPCR研究中具有多个优势，包括稳定受体在特定的活性或非活性状态以进行高分辨率结构分析，捕获短暂的信号中间体如GPCR-G蛋白或GPCR-阻断蛋白复合物，以及作为活细胞生物传感器以监测实时构象变化和受体活性。为了探索这些能力，我们评估了先前报道的缺乏PIONEER配置的内体，并首先专注于AGTR1，因为其外体已被广泛表征。

通过将内体与AGTR1结合，我们发现内体AT110和AT110i103能够适度增强AGTR1信号，其在峰值AGT-II水平下大约使输出翻倍，而AT110i1则有更强的效果，使信号输出增加超过十倍。值得注意的是，这些内体并未增加基础信号，这表明它们不会破坏G蛋白异三聚体以释放Gβ。相反，它们可能作为药理学伴侣，类似于CXCR4外体CA4139，通过增加受体的可用性来增强信号。如果如此，更强的伴侣效应应与更大的信号输出相关，这支持了该平台在识别各种GPCR的活性状态稳定内体方面的效用。

为了测试这些内体对AGTR1表面水平的影响，我们使用PIONEER基于的表面检测系统，在诱导内体表达后监测AGTR1的表面变化。正如预期的那样，我们观察到在表达AT110、AT110i103或AT110i1时，AGTR1的表面水平有所增加，而对照内体则没有变化。此外，这些表面变化与我们的信号分析结果一致，其中AT110i1的效果最为显著。这些数据支持了我们关于伴侣作用的假设，并强调了该平台在识别GPCR稳定内体方面的应用价值。

在AD101的测试中，我们发现其作为A2AR内体能够同时作为逆激动剂和完全抑制剂，这可能意味着其不会通过伴侣作用增加受体的可用性。这表明AD101的作用机制与AGTR1的内体不同。这些结果表明，该平台能够根据功能效应和伴侣能力区分GPCR内体的类别。不改变受体可用性的内体可能更适合于体内生物传感，而伴侣作用的内体可能有助于增强工程菌株的动态范围或支持结构研究中高亲和力结合者的识别。所有内体-受体结果的总结如图5f所示。

### PIONEER平台的未来应用与整合

PIONEER平台不仅适用于GPCR研究，还具有广泛的应用前景。通过将纳米抗体设计为可以分泌并展示为外体或保留在细胞内作为内体，该平台能够提供更精确的空间控制和功能分辨率。在药物发现、生物传感器开发和结构生物学等领域，PIONEER平台都能发挥重要作用，尤其是在识别构象选择性配体方面。

此外，PIONEER平台可以与人工智能技术相结合，以测试AI生成的分子在活系统中的活性、抑制或稳定作用。AI模型能够预测具有特定功能调节能力的肽、纳米抗体和蛋白质变体，但这些预测往往缺乏实验验证。在没有实验基础的情况下，即使高置信度的模型也可能产生在生物物理上合理但生物上无效的序列。PIONEER平台通过提供一个遗传编码的、可扩展的系统，能够将设计的序列与功能输出联系起来，从而为AI生成的分子提供功能解析，以评估和改进计算设计。

虽然本研究主要集中在GPCR上，但PIONEER框架对于目标类别并不敏感，适用于各种膜蛋白、相互作用伙伴和信号通路。例如，多种哺乳动物受体酪氨酸激酶（RTKs）在酵母中保留功能，并已被研究使用第一代Flo42为基础的自分泌设计。因此，PIONEER平台可以轻松适应这些系统，只需进行少量修改或与GPCR中心的平台如DCyFIR整合，以研究GPCR-RTK的相互作用。

更广泛地，PIONEER平台为研究任何遗传编码蛋白之间的相互作用提供了概念和实验基础。虽然大规模实施可能需要进一步的优化和基准测试，但该框架兼容高通量读数，如FACS和其他池选择策略。例如，使用该平台探索和优化分割报告系统或设计新的酶-底物对。在每种情况下，有效的互补或酶活性原则上都可以在高通量格式中解决，这建立在我们之前工作的稳健排序和选择策略之上。随着AI驱动的设计技术扩展到更复杂的生物系统，像PIONEER这样的框架，能够评估分子功能而非仅结合或结构，将变得不可或缺。

### 实验方法与数据采集

在实验过程中，我们采用了多种方法和技术，包括媒体和缓冲液的制备、统计分析、细胞培养、展示蛋白信息学、克隆和分子生物学、数据采集等。所有媒体、缓冲液和溶液的使用方法在补充表1中有所描述。数据报告为均值±标准差，并使用GraphPad Prism进行统计分析。两组之间的比较使用非配对双尾t检验，涉及多组的比较使用单因素方差分析。完整的统计结果在补充表4中提供。统计显著性定义为p < 0.05（*）、p < 0.01（**）、p < 0.001（***）和p < 0.0001（****）；p > 0.05视为不显著（ns）。

在细胞培养方面，我们使用了NEB? 5-alpha Competent Escherichia coli（DH5α衍生株）进行所有克隆实验和通用质粒扩增。所有酵母菌株都是BY4741（MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0）的衍生株，并在补充表2中列出。具体来说，我们使用了DI3Δfig1Δ::mTq2 P1 X-2模型菌株（BY4741 far1Δ0 sst2Δ0 ste2Δ0 Δ::mTq2 X-2:PTEF1a-UnTS-TCYC1b）或其衍生菌株，并已在先前工作中描述。在转化或其他实验之前，酵母菌株在YPD琼脂培养基上在30°C下生长3天。选择的菌株在液态YPD或pH调整的SCD筛选培养基中以200 rpm的振荡条件在30°C下培养。为了进行吸光度（A600）标准化步骤，我们使用了Biomek NXP液体处理机器人。

在展示蛋白的输出和效率评估中，我们使用了DI3Δfig1Δ::mTq2 P1 X-2酵母菌株，这些菌株被转化了pYEplac181 αPre-mTq2-X构建体（其中X是展示候选蛋白）。我们通过从SCD-LEU琼脂培养基中选择菌株并将其置于SCD-LEU培养基中进行培养，确保了菌株的生长条件。在21小时后，菌株被用于制备新的250微升培养物，在SCD筛选培养基中标准化为A600 0.1。培养物被离心（3000 g，5分钟）并转移到384孔板中，以测量分泌蛋白的相对荧光。显示效率的计算基于方程1，其中FsX是αPre-mTq2-X（Fs0是空载体）的相对荧光，而FtX是总相对荧光。

在分泌信号肽的输出和效率评估中，我们使用了pYEplac181 ss-mTq2构建体，并在相同的实验条件下进行测试。总荧光度被报告为总蛋白输出，而分泌效率则使用方程2进行计算，其中FsX和FtX分别是pYEplac181 ss-mTq2转化株的上清液和总细胞悬浮液的相对荧光度。

在PIONEER基于的分割荧光素酶实验中，我们使用了酵母菌株共转化pYEplac181 αPrePro-LgBiT-Ccw14（p-LgBiT）和pYEplac195 HiBiT-X（其中X是GPCR）。我们通过从SCD-URA-LEU琼脂培养基中选择菌株并将其置于SCD-URA-LEU培养基中进行培养，以确保菌株的生长条件。在21小时后，菌株被用于制备新的200微升培养物，在SCD筛选培养基中标准化为A600 0.2，并在30°C下进行培养。15小时后，菌株被用于制备80微升培养物，在白底384孔板中标准化为A600 1.0，并在加入furimazine（1:1000）后进行荧光素酶测量。数据被绘制为相对荧光单位（RLU）并使用GraphPad Prism进行分析。荧光素酶的倍数变化是相对于p-LgBiT仅有的情况计算的。

在GPCR激活实验中，我们使用了外源性配体激活方法。受体表达构建体（pYEplac195 GPCR）被转化到DI3Δfig1Δ::mTq2 P1 X-2酵母菌株（pYEplac195 Ste2）或衍生的DCyFIR菌株中。生成的转化株被从SCD-URA琼脂培养基中挑选出来，并置于SCD-URA培养基中进行培养。在18-21小时后，菌株被用于制备新的72微升重复培养物，在SCD筛选培养基中标准化为A600 0.11，并加入10倍浓度的药物或溶剂（H2O）。培养物被短暂离心，振荡后置于30°C的微孔板阅读器中进行数据采集。自动化数据采集和分析按照上述方法进行。

在自分泌GPCR激活实验中，我们使用了自分泌和PIONEERed配体激活方法。受体表达构建体与配体分泌构建体（pYEplac181 ss-ligand）或分泌和周质展示构建体（pYEplac181 ss-ligand-display）共同转化到DI3Δfig1Δ::mTq2 P1 X-2酵母菌株（pYEplac195 Ste2）或衍生的DCyFIR菌株中。生成的转化株被从SCD-URA-LEU琼脂培养基中挑选出来，并置于SCD-URA-LEU培养基中进行培养。在18-21小时后，菌株被用于制备新的80微升培养物，在SCD筛选培养基中标准化为A600 0.1，并置于30°C的微孔板阅读器中进行数据采集。自动化数据采集和分析按照上述方法进行。

在纳米抗体介导的GPCR信号调节实验中，我们测试了外体和内体对GPCR信号的调节作用。受体表达构建体通常与pYEplac181M2衍生的构建体共同转化，这些构建体双表达特定的纳米抗体和分泌配体。对于某些情况，如外源性配体添加，纳米抗体从pYEplac181M2构建体中表达，而不包含编码配体的构建体。生成的转化株被从SCD-URA-LEU琼脂培养基中挑选出来，并置于SCD-URA-LEU培养基中进行培养。在18-21小时后，菌株被用于制备新的1.5毫升培养物，在低葡萄糖SCD-URA-LEU培养基（1.9%半乳糖，0.1%葡萄糖）中标准化为A600 0.2，并置于30°C下进行培养。在15小时后，菌株被用于制备80微升培养物，在8种不同的SCD筛选培养基溶液中标准化为A600 0.1，保持总糖含量为2.0%。培养物被置于30°C的微孔板阅读器中，并每小时采集一次温度、A600和mTq2荧光数据。数据被绘制为荧光强度与A600的关系，并使用线性回归进行拟合，以生成每个处理条件的斜率和截距值，这些值用于将荧光强度标准化到A600 1.0，并报告为相对荧光单位（RFU）。最终的RFU数据被绘制为半乳糖百分比的函数，并使用四参数药理学函数进行拟合，以评估分泌配体的响应情况。在适用的情况下，误差条表示拟合斜率的标准差。

### 数据可得性与支持信息

本研究的所有数据均在论文及其补充信息中提供。支持信息包括实验方法、材料和试剂清单，以及相关专利信息。D.G.I.和J.B.R.是与PIONEER平台相关的美国实用专利申请的发明人（2023年11月29日提交）。其他作者声明没有竞争利益。

### 作者贡献

J.B.R.和D.G.I.构思了研究并共同撰写了论文。J.B.R.设计并执行了所有实验，得到K.L.的帮助。所有作者均声明无竞争利益。