《Journal of Chromatography A》：pH Effects on the Separation of Oligonucleotides by Ion-Pair Reserved Phase Liquid Chromatography Mass Spectrometry
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离子对反相色谱法通过调节pH值实现共流出、近等压脱氨杂质（DA）与母核的有效分离，酸性条件（1-2 mM HOAc）使DA同构体形成单一色谱峰简化定量分析，碱性条件（1-5 mM TBuAA）分离其他共流出杂质（如n-dMeC与n-T），质谱（MS）SIM模式提升低pH灵敏度，热处理样品验证UV与MS检测线性关系优于传统方法。
斯蒂利亚诺斯·G·鲁西斯（Stilianos G. Roussis）|克劳斯·伦特尔（Claus Rentel）
Ionis Pharmaceuticals公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德，邮编92010
摘要
由于合成反义寡核苷酸和小干扰RNA（siRNA）寡核苷酸具有很高的治疗潜力，近期人们对它们产生了浓厚的兴趣。在寡核苷酸制备过程中产生的低水平杂质的表征和监测颇具挑战性，尤其是那些与母体寡核苷酸具有相同分子量和相同质谱图的杂质。为了改善这些杂质的分离效果，本文研究了在离子对反相（IP-RP）色谱条件下pH值的影响。在酸性条件下，基于离子化程度（pKa）的差异，成功实现了与母体寡核苷酸共洗脱的近等摩尔杂质的有效分离。该方法产生一个色谱峰，包含了所有该杂质的各种位置异构体，从而大大简化了定量分析。而在碱性条件下，基于电负性/极性差异（PO）实现了其他共洗脱杂质的最优分离。通过将质谱仪（MS）设置为选择离子监测（SIM）模式，可以弥补在低pH条件下负离子MS分析通常存在的灵敏度较低的问题。对经过热处理（80°C，0-7天）的样品进行脱氨程度分析，发现使用紫外光谱和质谱方法都能得到线性关系。例如，该方法成功分离了n-DMeC与n-T以及n-MOE MeC与n-MOE T之间的近等摩尔杂质。这种新的pH调控方法比需要样品脱硫或高分辨率质谱（HRMS）实验来测量同位素峰分布差异的方法更快、更简单。
部分内容摘录
引言
合成寡核苷酸（如反义寡核苷酸和小干扰RNA（siRNA）是一类具有显著治疗潜力的新兴治疗药物。[1],[2],[3],[4] 这类药物独特的药理作用机制源于它们能够通过沃森-克里克碱基配对选择性结合RNA来调节基因表达。[5],[6] 了解目标基因的初级序列有助于合理筛选候选寡核苷酸药物。
仪器设备
实验使用的是Agilent 1260 Infinity II液相色谱仪，配备了四元泵、自动进样器、加热柱室和二极管阵列紫外检测器。该色谱系统与Agilent InfinityLab LC/MSD XT四极杆质谱仪相连，后者配备了电喷雾离子化（ESI）源。实验中使用的干燥气体和雾化气体均为氮气，干燥气体温度为350°C，气体流速为12 L/min，雾化压力为50 psig。
需要改进共洗脱和等摩尔寡核苷酸杂质的分离效果
化学修饰寡核苷酸的连接链中存在硫原子时，会在磷原子上形成手性中心，从而产生大量非对映异构体（即2^m个非对映异构体，其中m表示磷硫酸酯（PS）连接的数量）。理想的IP试剂和色谱条件应能使这些杂质的所有非对映异构体峰合并为一个单一峰，以便进行定量分析。
结论
研究了pH值对某些寡核苷酸降解产物分离的影响。研究发现，通过向（1-5 mM）TBuAA IP缓冲液中加入1-2 mM的HOAc将pH值调至酸性条件，可以有效分离脱氨（DA）杂质与母体寡核苷酸。观察到一个色谱峰，其中包含了该杂质的所有位置异构体，这大大简化了定量分析过程。
作者贡献声明
斯蒂利亚诺斯·G·鲁西斯（Stilianos G. Roussis）：负责撰写、审稿与编辑、原始稿撰写、方法学设计及实验实施。克劳斯·伦特尔（Claus Rentel）：同样负责撰写、审稿与编辑、方法学设计及实验实施。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文研究结果的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢D. C. Capaldi对手稿的严格审阅及其宝贵建议。
