将SWIEET提取方法微型化，用于评估摇蚊（Chironomus riparius）在变态后体内残留的代森锰锌（carbendazim）含量

《Journal of Chromatography A》：Miniaturization of the SWIEET extraction method to assess the body burden of carbendazim in Chironomus riparius midges after metamorphosis

针对中华按蚊等小型无脊椎动物，本研究优化了盐-free SWIEET液液萃取法，成功实现单只体重0.3-0.5 mg成蚊中卡百大津的提取。通过调整萃取体积至0.5 mL，结合矩阵匹配校正和样本 pooling策略，在0.4-8 mg/kg暴露浓度下获得86%平均回收率。研究发现矩阵效应导致离子增强，需根据样本数量优化校准方法，单只提取LOD达0.07 μg/L。该技术为研究低剂量农药暴露下的个体差异提供了新方法。

　　在环境科学和毒理学研究中，生物样本中痕量污染物的检测是一项具有挑战性的任务。特别是对于那些体重极轻的水生昆虫，如水蚤（*Chironomus riparius*）这类具有水生幼虫阶段的昆虫，由于其生物量小，传统的提取方法往往难以直接应用。这类样本的分析不仅需要高灵敏度的检测技术，还要求提取方法能够有效适应极小的生物量。为了解决这一问题，研究团队开发了一种新的无盐提取方法——SWIEET（sugar water isopropanol ethyl nitrile extraction technique），旨在为微小样本的痕量污染物分析提供更高效的解决方案。

SWIEET方法的原始版本适用于5 mL的总提取体积，但为了检测水蚤体内痕量的杀菌剂——苯并咪唑（carbendazim），研究团队对其进行了微型化改进。水蚤的成虫体重在0.3至0.5毫克之间，这意味着在提取过程中必须将总溶剂体积显著减少，以避免过度稀释目标污染物，同时确保提取效率。微型化后的SWIEET方法将总提取体积控制在0.5 mL左右，这一体积的选取基于初步实验，发现随着提取体积的减少，目标分析物的回收率也相应下降，但考虑到小体积提取的必要性，这种折中方案能够在不显著降低回收率的前提下，满足实际分析的需求。

为了验证这一微型化方法的可行性，研究团队使用了13种模型分析物的混合物进行实验。这些分析物涵盖了多种极性和非极性化合物，其回收率在不同的提取体积下表现出一定的变化。实验结果显示，当总提取体积从5 mL减少到0.5 mL时，平均回收率从61%下降至46%。这一下降可能与小体积提取过程中操作的精确性以及相分离效率有关。然而，尽管回收率有所降低，但这一体积仍能够支持对单个水蚤样本的分析。此外，研究团队还发现，极性分析物的回收率下降幅度比非极性分析物更大，这表明在微型化过程中，极性化合物的提取效率受到了更显著的影响。

在实际应用中，研究团队进一步将这一方法应用于水蚤成虫样本的分析。他们从水蚤幼虫暴露实验中提取了成虫样本，并使用该方法检测了其中的苯并咪唑含量。为了提高检测的准确性，研究团队采用了与样本基质相匹配的校准曲线，而不是传统的内标法。这是因为苯并咪唑的同位素标记标准品在市场上并不容易获得，而使用市售的氘代标准品则无法获得稳定的信号，导致校准偏差较大。因此，选择与样本基质一致的校准方法成为确保结果准确性的关键。

在实际实验中，研究团队发现，使用3个水蚤样本进行合并提取能够显著提高检测的稳定性，减少因样本基质差异导致的信号波动。然而，对于最低浓度的暴露实验，他们需要将样本数量增加到6个以确保检测信号能够超过检测下限（LOD）。这一结果表明，尽管微型化方法在一定程度上提高了对单个样本的提取能力，但为了确保数据的可靠性和重复性，仍然需要对样本进行适当的合并。此外，研究团队还通过空白提取实验验证了该方法对矩阵效应的处理能力。他们发现，当样本数量增加时，矩阵效应的强度也随之变化，这表明不同样本数量对检测结果的影响不容忽视。

在实际分析中，研究团队对不同暴露浓度下的水蚤样本进行了提取，并通过LC-MS技术检测了其中的苯并咪唑含量。结果表明，随着暴露浓度的增加，水蚤体内的苯并咪唑含量也随之上升，这符合预期的生物累积趋势。然而，由于样本中苯并咪唑的绝对浓度较低，尤其是在最低暴露浓度的情况下，检测结果的变异系数较大，这可能与仪器的灵敏度以及样本的天然差异有关。为了减少这种变异，研究团队采用了多重复的检测方法，并对每个样本进行了三次独立的测量。

此外，研究团队还探讨了样本合并对检测结果的影响。他们发现，使用不同数量的样本进行合并提取能够有效降低检测结果的波动性。例如，在最低暴露浓度的实验中，使用6个样本进行合并提取，能够获得更稳定的信号，而使用3个样本则在较高浓度下表现良好。这一结果表明，样本合并的策略需要根据具体的暴露浓度和检测目标进行调整，以确保结果的可靠性和可重复性。

为了进一步验证该方法的可行性，研究团队还进行了与其他方法的比较。例如，他们使用了QuEChERS方法对水蚤样本进行了提取，但发现由于QuEChERS方法需要使用大量的盐来实现两相分离，这在处理极小的样本时会导致盐的浓度异常升高，从而影响提取效率和检测准确性。相比之下，SWIEET方法通过添加葡萄糖来实现相分离，避免了盐的使用，从而在处理微小样本时更具优势。这一方法不仅减少了对仪器的依赖，还降低了化学试剂的消耗，使其在环境分析中更加环保和经济。

在实验过程中，研究团队还发现，样本的干燥处理对提取结果具有重要影响。由于水蚤的干燥体重非常小，任何微小的误差都可能对最终的检测结果产生显著影响。因此，他们采用了精确的称量方法，确保每个样本的处理都符合实验要求。此外，他们还对提取过程中的各个步骤进行了优化，包括溶剂的配比、混合时间以及离心条件等，以提高提取的效率和准确性。

在数据处理方面，研究团队采用了多种统计方法来评估检测结果的可靠性。例如，他们计算了不同样本数量下的变异系数，并通过t检验和ANOVA分析了不同处理组之间的差异。结果表明，尽管样本数量的增加能够提高检测的稳定性，但样本数量的减少并未显著影响检测结果的准确性，这说明该方法在处理小样本时具有良好的重复性。此外，研究团队还发现，样本的天然差异可能是导致检测结果波动的一个重要因素，因此在分析时需要充分考虑这一点。

总体而言，研究团队通过微型化SWIEET方法，成功实现了对水蚤样本中痕量污染物的检测。这一方法不仅克服了传统提取技术在处理小样本时的局限性，还为环境科学中的痕量污染物分析提供了新的思路。然而，该方法仍存在一些需要进一步优化的地方，例如，如何在保持高回收率的同时，减少样本合并带来的误差，以及如何提高检测的灵敏度以适应更低的暴露浓度。此外，研究团队还提到，未来的研究可以考虑引入更多的清洁步骤，如固相萃取（dSPE），以进一步减少基质效应，提高检测的准确性。

在实际应用中，该方法的微型化不仅有助于提高检测效率，还能够减少实验成本和时间。由于水蚤样本的处理需要大量的手动操作，微型化方法在一定程度上简化了实验流程，使得研究人员能够更高效地进行分析。此外，该方法的环保特性也使其在实际应用中更具吸引力，特别是在需要处理大量微小样本的情况下。

综上所述，研究团队通过开发和优化SWIEET方法，成功实现了对水蚤样本中痕量污染物的检测。这一方法的微型化不仅提高了对小样本的处理能力，还为环境科学中的痕量污染物分析提供了新的技术路径。然而，为了进一步提高检测的准确性，研究团队建议未来的研究可以探索更多清洁步骤和优化方法，以减少基质效应并提高检测的灵敏度。此外，该方法的应用范围还有待扩展，以适应更多种类的微小生物样本。