前额叶催产素受体阳性细胞通过应激诱导的焦虑介导结节性硬化症的社交隔离效应

《Communications Biology》：Prefrontal oxytocin receptor positive cells mediate stress-induced anxiety in tuberous sclerosis complex

本研究针对结节性硬化症(TSC)患者高发的病理性焦虑问题，通过在催产素受体表达细胞(OTRCs)中条件性敲除Tsc2基因，揭示了社交隔离压力通过激活TSC-Rheb-PERK信号轴，导致前额叶皮质(mPFC)功能抑制和焦虑样行为产生的机制。研究发现雄性突变体表现为焦虑行为增强和社交动机改变，而雌性则表现出应激韧性，PERK抑制剂可逆转相关行为异常，为TSC相关焦虑的治疗提供了新靶点。

　　

在神经科学领域，理解压力如何诱发焦虑等情绪障碍一直是个核心问题。对于患有结节性硬化症（Tuberous Sclerosis Complex, TSC）这种神经发育障碍的个体来说，这个问题尤为紧迫，因为病理性焦虑在TSC患者中极为普遍，是TSC相关神经精神障碍（TAND）中最主要的临床负担之一。TSC是由TSC1或TSC2基因突变引起的，这些基因编码的蛋白质构成TSC复合物，负向调控mTORC1信号通路。然而，尽管在TSC的认知缺陷方面已有较多研究，但对于TSC相关焦虑的神经生物学基础，特别是从分子信号通路、神经调制到环路功能的多层次机制，仍然知之甚少。

另一方面，催产素（Oxytocin, OT）系统作为调节应激反应和增强社会刺激显著性的关键神经调质系统，其作用备受关注。催产素通过其G蛋白偶联受体（Oxytocin Receptor, OTR）发挥作用，在特定脑区（如下丘脑、杏仁核和前额叶皮层）的催产素受体表达细胞（OTR-expressing cells, OTRCs）中，OTR的表达具有经验和性别依赖性。研究表明，在应激暴露下，OT能抑制下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的激活，发挥抗焦虑作用。内侧前额叶皮层（medial Prefrontal Cortex, mPFC）作为整合感觉、运动和边缘系统输入的关键脑区，在情绪调节中扮演重要角色。有证据提示mPFC中的OTRCs可能通过调节局部微环路来影响情绪行为，但其在TSC相关焦虑中的作用尚不清楚。

此外，慢性社交隔离（Social Isolation Stress, SIS）是一种强大的心理社会应激源，会导致适应不良的情感状态。TSC患者可能因其遗传易感性而对这种压力更为敏感。TSC2蛋白作为GTP酶激活蛋白（GAP），负向调控小G蛋白Rheb（Ras homolog enriched in brain）。Rheb激活后能同时刺激mTORC1和PKR样内质网激酶（PERK），后者是整合应激反应（Integrated Stress Response, ISR）的启动者。ISR在短期内是一种保护性信号通路，但长期激活则会损害神经元功能。研究人员推测，在OTRCs中特异性破坏Tsc2可能会通过过度激活正常情况下受TSC复合物抑制的通路，增加对社交隔离的易感性，从而引发适应不良的焦虑样行为。

为了验证这一假设，由Olivia Tabaka和Saheed Lawal作为共同第一作者，Prerana Shrestha和Eric Klann作为共同资深作者领导的研究团队在《Communications Biology》上发表了他们的研究。他们旨在探讨Tsc2单倍体不足（haploinsufficiency）与慢性社交隔离压力在塑造情感行为及 underlying 皮层环路功能中的相互作用，特别是OTRCs在其中的关键作用。

为开展此项研究，作者们运用了多种关键技术方法。他们首先利用OTR-Cre转基因小鼠与Tsc2条件性基因敲除（floxed）小鼠交配，构建了在OTRCs中特异性杂合缺失Tsc2的小鼠模型（cHET）。研究队列包括3-6月龄的雄性和雌性小鼠。行为学分析是核心手段，包括旷场实验、高架十字迷宫、弹珠埋藏实验、三室社交互动测试、居住者-入侵者测试和交配测试等，以评估焦虑样行为、动机和社交行为。在分子水平，他们通过免疫荧光染色检测了mPFC中OTRCs的TSC2蛋白水平以及mTORC1（磷酸化S6核糖体蛋白p-S6RP）和PERK（磷酸化eIF2α, p-eIF2α）通路的活性。此外，还采用荧光非常规氨基酸标记（FUNCAT）技术检测了离体脑片中新生成蛋白的合成。在环路功能层面，研究人员进行了离体脑片场电位记录，评估mPFC层2/3刺激后在层5记录到的场兴奋性突触后电位（fEPSP），并观察了OTR激动剂[Thr⁴, Gly⁷]-oxytocin (TGOT) 以及PERK抑制剂GSK2606414或P/Q型钙通道阻断剂ω-Agatoxin IVA对网络兴奋性的影响。药理学干预包括系统性给予mTORC1抑制剂雷帕霉素（rapamycin）或PERK抑制剂GSK2606414。最后，通过立体定位注射携带Cre依赖性Rheb shRNA的慢病毒载体，实现了在mPFC的OTRCs中进行细胞类型特异性的Rheb基因敲低（knockdown），以验证该信号轴的行为学功能。

细胞类型特异性删除OTRCs中的Tsc2改变应激下的能量平衡

研究人员首先确认了mPFC中OTR+神经元的分布，发现雄性小鼠前边缘皮层（prelimbic）的OTR+神经元数量显著高于雌性。通过病毒介导的标记和免疫染色，他们证实cHET小鼠mPFC的OTR+神经元中TSC2蛋白水平降低了32%。在长达两个月的慢性社交隔离后，雄性cHET小鼠体重增长异常，但摄食量无变化，提示能量消耗增加。而雌性cHET小鼠则能维持正常体重增长，WT雌性反而体重增长受抑，显示出性别特异性的能量平衡调节差异。

应激易感性中的行为学性别差异

行为学测试揭示了显著的行为差异。在社交隔离后，雄性cHET小鼠在旷场实验中表现出更强的趋触性（thigmotaxis，即靠近边缘活动）和中心区域探索减少，在高架十字迷宫中开放臂停留时间缩短，并且弹珠埋藏行为减少，表明焦虑样行为加剧和动机缺损。相反，雌性cHET小鼠在群养时表现出较低的焦虑样行为（旷场中心探索时间更长），且在社交隔离后，虽然WT雌性弹珠埋藏减少，但cHET雌性却不受影响，显示出对动机缺损的抵抗力。自我理毛行为在各组间无差异，说明行为改变具有特异性。

社交互动中的性别二态性

社交行为测试结果进一步凸显了性别差异。在群养和社交隔离后，雄性cHET和WT小鼠均保持正常的社交偏好。社交隔离后的雄性cHET小鼠在居家笼双鼠互动测试中表现出更多的亲社会行为（如嗅探、互理毛发），但攻击行为和与发情期雌鼠的交配行为正常，提示其增强的社交互动可能是应对压力的缓冲机制。然而，雌性cHET小鼠在社交隔离后，在三室社交互动测试中失去了对陌生雌鼠的社交偏好，表现为社交动机减弱，尽管其在非社交焦虑测试中表现正常。这表明Tsc2单倍体不足导致了两性对慢性社交隔离的不同行为适应策略：雄性表现为应激诱导的过度社交，而雌性则表现为社交驱动力钝化。

下游TSC效应物药理抑制的选择性抗焦虑作用

分子机制研究表明，社交隔离后的cHET小鼠mPFC OTRCs中，mTORC1（p-S6RP增加70%）和PERK（p-eIF2α增加67%）信号通路均被显著激活。药理学干预发现，给予mTORC1抑制剂雷帕霉素能恢复雄性cHET小鼠的弹珠埋藏行为（动机），但不能挽救其旷场中心回避行为（焦虑）。而给予PERK抑制剂GSK2606414则能显著改善雄性cHET小鼠的焦虑样行为（增加旷场中心探索）并恢复其动机行为。在雌性cHET小鼠中，PERK抑制剂（而非雷帕霉素）能够挽救社交隔离诱导的社交回避行为，恢复其社交偏好。值得注意的是，PERK抑制剂在WT雌性中反而废除了正常的社交偏好，表明PERK活性存在一个维持正常社交行为的最适窗口。

mPFC OTRCs中细胞特异性敲低Rheb可挽救应激诱导的行为回避

为了定位神经基质，研究者在mPFC的OTRCs中特异性敲低了Rheb。结果显示，Rheb敲低在cHET小鼠中效率更高（降低46.6%），这可能与Tsc2单倍体不足背景下Rheb降解调控改变有关。行为上，在雄性cHET小鼠中，mPFC OTRCs的Rheb敲低增加了其自发活动量和旷场中心探索，类似于全身性PERK抑制的效果。在雌性cHET小鼠中，该操作则挽救了社交隔离后的社交接近缺陷，恢复了正常的社交偏好。然而，该操作未能挽救雄性cHET小鼠的弹珠埋藏行为缺陷，提示动机缺损可能由mPFC以外的OTRCs（如纹状体）所介导。

mPFC中功能失调的OTRCs介导网络抑制

功能学研究揭示了细胞和环路水平的改变。FUNCAT实验表明，社交隔离后cHET雄性小鼠mPFC OTRCs的新生蛋白合成减少了28%，表明其翻译能力受损。电生理记录发现，在WT雄性小鼠mPFC脑片上，OTR激动剂TGOT可引起场电位（fEPSP）幅度增加，表明网络兴奋性增强；然而这一效应在cHET雄性小鼠中缺失。在雌性小鼠中，TGOT对WT和cHET的mPFC网络兴奋性均无显著影响，与之前报道的雌性mPFC中OTR激活主要增强抑制性突触后电流（IPSCs）的结果一致。进一步实验表明，PERK抑制剂GSK2606414处理可挽救cHET雄性小鼠mPFC中TGOT诱导的网络抑制。此外，使用P/Q型钙通道阻断剂ω-Agatoxin IVA（主要抑制快放电的PV⁺中间神经元）预处理脑片，可以挽救cHET雄性小鼠中TGOT诱导的网络抑制，表明Tsc2缺陷的OTRCs可能导致了对PV中间神经元的抑制控制失灵，从而引起PV中间神经元过度活跃和锥体神经元输出抑制。

研究结论与意义

本研究深入揭示了Tsc2单倍体不足与慢性社交隔离压力交互作用下的神经机制。研究发现，在OTRCs中特异性缺失Tsc2会通过激活TSC-Rheb-PERK信号轴，特别是PERK介导的整合应激反应（ISR），导致mPFC局部蛋白合成抑制和网络功能紊乱（表现为兴奋性降低），最终引发性别特异性的焦虑样行为和社交动机改变。在雄性小鼠中，主要表现为mPFC功能抑制、焦虑增强和寻求社交作为应对机制；而在雌性小鼠中，则表现为社交动机减弱但非社交焦虑测试中的韧性。

该研究的创新性在于将TSC相关焦虑的机制定位到特定的细胞类型（OTRCs）、特定的脑区（mPFC）和一条相对新颖的信号通路（PERK-ISR）。研究结果表明，尽管mTORC1和PERK通路在Tsc2缺陷的OTRCs中均被激活，但PERK-ISR通路在应激诱导的情感行为异常中扮演了更为关键的角色。药理学抑制PERK能够有效逆转行为缺陷和部分电生理异常，这为治疗TSC相关的病理性焦虑，以及其他可能与应激和OT系统功能障碍相关的精神疾病，提供了新的潜在治疗靶点。同时，研究强调了对神经精神疾病进行性别特异性研究和治疗策略开发的重要性。未来的研究可以进一步探索ISR在OTRCs中影响mPFC微环路（例如通过CRHBP信号）的具体下游机制，以及在不同发育阶段进行干预的时机效应。