利用空间转录组学解析多发性骨髓瘤骨髓微环境的时空异质性

《Communications Biology》：Characterization of the bone marrow architecture of multiple myeloma using spatial transcriptomics

本期推荐一项突破性研究：为揭示多发性骨髓瘤(MM)恶性浆细胞(MM-PC)与骨髓(BM)微环境的空间互作机制，研究团队首次建立适用于脱钙骨组织的Visium空间转录组技术体系，通过对MM小鼠模型及患者FFPE样本分析，发现MM-PC存在转录异质性，并揭示效应T细胞向耗竭T细胞表型转换的空间梯度分布特征。更关键的是，研究首次在空间维度证实NETosis（中性粒细胞胞外诱捕网形成）和IL-17信号通路在肿瘤低浸润区活性更高，为靶向微环境疗法开辟新视角。

　　

在血液系统恶性肿瘤中，多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma, MM)始终是难以攻克的堡垒。这种疾病以骨髓中恶性浆细胞(Malignant Plasma Cells, MM-PC)的克隆性增殖为特征，但更棘手的是，这些癌细胞并非孤立存在——它们深嵌于高度组织化的骨髓(Bone Marrow, BM)微环境中。这个由基质细胞、免疫细胞、血管网络等构成的复杂生态系统，如同肿瘤的“庇护所”，既促进癌细胞增殖，又介导药物抵抗。然而，传统技术难以捕捉细胞间的空间对话，科学家们一直缺乏全景视角来揭示微环境中“谁在哪儿、做什么”的关键谜题。

面对这一挑战，Emma Muinos-Lopez等研究者将目光投向新兴的空间转录组学(Spatial Transcriptomics)。但骨髓作为高度矿化的硬组织，其研究面临独特障碍：脱钙处理会降解RNA，细胞密度低导致基因漏检，现有平台缺乏单细胞分辨率。这项发表于《Communications Biology》的研究，通过优化Visium空间基因表达技术(10x Genomics)在福尔马林固定石蜡包埋(Formalin-Fixed Paraffin-Embedded, FFPE)骨组织中的应用，首次实现对完整矿化骨髓的空间转录组解析，为理解MM发病机制提供了前所未有的时空地图。

关键技术方法概述

研究团队建立了一套完整的技术体系：首先优化小鼠和人类FFPE骨髓样本的脱钙处理流程（EDTA脱钙10天），采用Visium CytAssist空间基因表达方案进行文库构建，通过Illumina NextSeq2000平台测序。利用Seurat和STutility软件包进行数据预处理，结合已发表的鼠源单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)数据和研究者自有MM-PC单细胞数据整合的scBMReference数据集，通过CARD算法进行空间点解卷积分析。通过AUCell计算基因集活性评分，采用差异表达分析和基因富集分析挖掘空间区域特征，并通过免疫组化(Immunohistochemistry, IHC)对关键发现进行验证。人类样本来自6例MM患者和3例健康对照的存档活检组织。

空间分辨率揭示健康骨髓细胞分布格局

研究团队首先对健康小鼠股骨进行空间转录组分析，在骨小梁区检测到1242个空间点。通过解卷积分析成功绘制主要细胞类型的空间分布图：中性粒细胞作为主要群体集中于骨干区域，而红细胞前体与B细胞呈现正空间相关性，暗示功能协同。聚类分析识别出四个特征明确的区域（CN1-CN4），分别以树突状细胞(Dendritic Cells, DC)、中性粒细胞、T细胞为主导。这一基础图谱为后续病理对照研究奠定基石。

骨髓瘤骨髓转录空间图谱解析

在MM小鼠模型中，研究观察到恶性浆细胞的浸润呈现出显著空间异质性。通过整合健康参考数据集和MM-PC单细胞数据，研究将空间点划分为七个功能簇（CM1-CM7）。值得注意的是，MM-PC高浸润区域（CM5-CM7）与红细胞前体、中性粒细胞等造血群体呈负相关，而与树突状细胞呈正相关，印证了肿瘤细胞对正常造血的空间排挤效应。免疫组化检测GFP（标记MM-PC）进一步验证了空间转录组结果的可靠性。

浆细胞空间异质性的分子表征

深入分析发现，即使在高肿瘤细胞密度区域，MM-PC也呈现显著转录异质性。研究通过数据驱动方法将肿瘤区域划分为“远程区”(Remote zone)、“边界区”(Border zone)和“热点区”(Hotspot)，并在此基础上识别出12个转录 distinct 的MM-PC亚群（Pg1-Pg12）。这些亚群表达不同的基因程序，包括B2m、Ptp4a3、Ly6k等与MM发展相关的基因。内质网应激通路显著富集，呼应了内质网在MM耐药中的已知作用。

骨髓瘤发病相关转录程序的空间识别

最具启发性的发现来自肿瘤微环境的空间分析。T细胞虽均匀分布，但其功能状态呈现明确空间梯度：效应T细胞富集于肿瘤“热点区”，而耗竭T细胞表型在“边界区”占主导。这种分布模式提示了肿瘤核心区持续的免疫攻击与周边区域免疫衰竭的动态平衡。通过差异表达分析，研究团队发现NETosis（中性粒细胞胞外诱捕网形成）、IL-17信号、动脉粥样硬化等通路在肿瘤低浸润区（远程区）活性显著更高。关键基因如Padi4、Pik3cd、Mmp9的空间表达模式及IHC对瓜氨酸化组蛋白H3(H3-cit)的检测共同证实，NETosis过程确实远离MM-PC富集区域。

人类骨髓样本的空间转录组验证

在人类样本中，研究通过CD38/CD138免疫组化确认肿瘤区域，并应用相同分析流程验证小鼠模型的关键发现。尽管人类样本中T细胞功能状态的空间梯度不如小鼠明显（效应T细胞和耗竭T细胞在热点区均有增加趋势），但NETosis和IL-17相关通路同样在远离肿瘤区域显示更高活性，表明这种微环境重塑在物种间具有保守性。

研究结论与展望

这项研究在方法学上实现了重要突破，成功将Visium空间转录组技术应用于矿化骨组织，建立了FFPE骨髓样本的空间分析流程。在生物学层面，研究首次在空间维度揭示MM微环境的动态重塑：随着与肿瘤细胞距离增加，微环境表现出炎症反应、中性粒细胞活性和基质重塑的渐进式增强。特别值得注意的是，NETosis和IL-17信号等通路在肿瘤远端的高活性，提示这些过程可能被肿瘤细胞主动抑制或排除。

研究的局限性包括样本量有限、技术分辨率限制以及单一切片可能遗漏三维异质性。然而，这项工作为理解MM空间生物学奠定基础，提供的分析框架可扩展到其他骨相关疾病研究。未来结合更高分辨率空间技术、单细胞测序和三维重建，将能更精确解析骨髓微环境中细胞互作的分子细节，为开发靶向微环境的治疗策略提供新思路。