综述：从诊所到实验室：用于马体外胚胎生产的精子参数

《Journal of Equine Veterinary Science》：From Clinic to Lab: Sperm parameters for Equine In Vitro Embryo Production

马胚胎体外生产（IVP）通过显微注射（ICSI）或常规体外受精（IVF）技术提升繁殖效率，尤其适用于亚生育力、突发死亡或精子不足等情况。研究指出，品种（如阿拉伯马与 quarter horse差异）、年龄（老龄化导致精子异常）、精子来源（射精、附睾冲洗或性别分选精子）及保存方法（冷却、冷冻或新型技术）显著影响IVP成功率。精子筛选技术（密度梯度离心、 swim-up、微流控）和冷冻保护剂优化（如低卵磷脂配方）是关键创新点，而ICSI对精子质量要求较低，IVF则需更高活力精子。未来需加强实验室与临床协作，优化精子处理全流程以匹配需求增长。

　　在现代畜牧业中，随着科技的不断进步，体外受精（IVP）技术已经成为提高优质种马繁殖效率的重要手段。这一技术特别适用于那些因不育、突然死亡、紧急安乐死或精子供应有限等情况而无法通过传统方式繁殖的种马。近年来，IVP的成功率持续提升，使其成为最受欢迎的辅助生殖技术之一。因此，兽医和种马饲养者需要掌握如何提供适合IVP的精子，特别是在选择用于显微注射（ICSI）或常规体外受精（IVF）的完整精子方面。为了满足这一需求，必须综合考虑动物选择、精子处理以及精子筛选技术，将日常临床实践与实验室需求紧密结合。本文旨在总结与种马和精子参数相关的研究，为提高体外生殖结果提供实用的指导。

### 1. 引言

在过去几年中，体外技术作为管理生育能力的一种方法，在人类和家畜物种中得到了广泛应用。在马匹繁殖领域，体外受精技术如ICSI被广泛用于解决母马和公马的不育问题，以及繁殖管理中的实际困难。通过体外受精，研究人员和兽医能够克服传统繁殖方式的局限，实现更高效的胚胎生产。目前，体外受精已成为一种重要的技术手段，其应用范围不断扩大，为马匹繁殖提供了新的可能性。

### 2. 种马因素

种马的因素在体外受精的成功中扮演着至关重要的角色。首先，种马的品种差异会影响精子的质量，包括精浆参数等。例如，在临床实践中，阿拉伯种马的胚胎生产率通常低于其他品种如四分之一英里马和温血马。虽然这种不育现象可能是由于种马本身的遗传因素或母马的生育能力较低，但目前大多数关于品种与生育能力的研究仍基于临床程序，而非受控实验。

其次，种马的年龄也会影响其生育能力。与母马不同，公马在整个生殖期内持续产生精子，而母马的卵子数量在胎儿期形成后保持不变。因此，种马的生育能力随着年龄增长而逐渐下降，可能导致精子形态异常增加。然而，由于ICSI技术能够选择形态正常且具有运动能力的精子，年龄相关的生育能力下降通常不会成为ICSI的障碍。

此外，种马的生育能力评估通常基于精子参数和体内受孕率。传统方法如解冻后的精子运动能力并不能准确预测体外受精的成功率。例如，一些研究表明，解冻后运动能力低于10%的种马其胚胎生产率较低。同样，即使种马体内不育，只要存在运动精子，ICSI仍然可以产生胚胎，但其成功率相对较低。另一个重要发现是，具有较高活细胞比例和HOS阳性细胞（表示尾部膜功能正常）的精子，其ICSI结果更佳，而形态和DNA完整性则与结果无明显关联。此外，由于不适当的处理方式，如氮气罐故障，可能导致精子受损，从而影响胚胎生产。最近的研究还发现，解冻后精子的运动能力为44%，形态正常的精子比例为56%，这种情况下胚胎生产率显著提高。基于这些研究，种马或精液批次的选择不能仅依赖于解冻后的运动能力，而应考虑进行ICSI测试试验，以获得更准确的预测结果。

在常规IVF中，新鲜和解冻精子的运动能力与成功率为高度相关，这突显了选择优质种马或精液的重要性。同时，一些研究表明，不同种马的精液批次在胚胎生产率上存在差异，这可能是由于初始精液质量或精液处理和保存方法的不同所致。因此，精液处理过程中需要充分考虑这些因素，以提高IVP的成功率。

### 3. 精子来源

在体外受精过程中，精子来源的选择对最终的胚胎生产至关重要。常见的精子来源包括射出精液、附睾冲洗液以及性别的筛选精子。

首先，射出精液是传统的来源，由精液和附性腺分泌物组成。精浆在精子成熟、功能和受精过程中起着重要作用，特别是在将精子从雄性生殖道运输到雌性生殖道的过程中。然而，精浆成分可能对冷冻和解冻后的精子存活率产生负面影响。一些研究表明，未去除精浆的样本在解冻后更容易出现运动能力下降和DNA完整性受损。因此，在进行ICSI时，精浆的去除变得尤为重要，因为精浆的存在可能会影响精子与卵子的结合能力。然而，在常规IVF中，精浆的去除是必要的，以促进精子的成熟过程。

其次，附睾冲洗液是一种重要的精子来源，尤其是在种马突然死亡或需要紧急处理的情况下。附睾冲洗液中的精子通常缺乏精浆成分，因此在ICSI中表现出与射出精液相似的胚胎生产率。这表明，精浆的暴露并非体外受精所必需。然而，附睾冲洗液的使用仍存在一定的争议，部分研究认为其在体内繁殖中的成功率较低，而另一些研究则显示其与射出精液的效果相近。

最后，性别筛选精子（SS）在马匹繁殖中的应用受到限制，主要是因为其冷冻解冻后的存活率较低。然而，随着技术的进步，一些先进的性别筛选方法，如STgenetics公司使用的SuperGen?筛选器和Ultraplus?处理方法，已经取得了显著成效。这些方法能够提高体外受精的成功率，使性别筛选精子在临床实践中更具可行性。此外，性别筛选精子在解冻后的运动能力较低，因此在进行ICSI时，需要采用特殊的筛选方法，以确保精子的质量和活性。

### 4. 精子保存方法

精子保存方法在体外受精的成功中同样扮演着关键角色。常见的保存方法包括新鲜精子、冷却精子和冷冻精子。

首先，新鲜精子的使用在体外受精中具有较高的成功率，因为其保存时间较短，能够保持较高的运动能力和DNA完整性。然而，新鲜精子的使用受到时间限制，通常只能在短时间内使用。因此，冷却精子成为一种重要的替代方案。冷却精子可以通过人工授精技术进行保存，并且能够在一定程度上延长其使用时间。研究表明，冷却精子的胚胎生产率与冷冻精子相近，但某些情况下，如种马的精液质量较高，冷却精子的表现可能优于冷冻精子。

其次，冷冻精子是目前最常用的保存方法，特别是在种马的繁殖管理中。冷冻精子不仅能够长期保存，还能够在不同地理位置之间进行运输和储存。冷冻精子的保存需要特定的冷冻介质，如甘油、二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亚砜（DMSO）。不同冷冻介质对精子的保存效果存在差异，例如，使用DMSO冷冻的精子在ICSI中的胚胎生产率高于使用甘油冷冻的精子。然而，冷冻精子的保存过程可能会影响精子的膜完整性和DNA完整性，因此在选择冷冻介质时需要综合考虑这些因素。

此外，一些替代的保存方法，如“动力冷冻”（kinetic vitrification）和干燥保存，正在被探索。动力冷冻是一种超快速冷冻技术，能够在不使用渗透性冷冻保护剂的情况下保存精子，避免了渗透压失衡的问题。而干燥保存则涉及将精子制成薄片并在室温下干燥，之后需在5°C下保存。尽管这些方法在某些情况下显示出一定的潜力，但它们的广泛应用仍受到技术成熟度和成本的限制。

### 5. 精子筛选方法

在进行体外受精时，精子筛选方法的选择对最终的胚胎生产至关重要。常见的筛选方法包括密度梯度离心（DGC）、游泳法（SU）和微流控技术（MF）。

密度梯度离心是一种广泛使用的筛选方法，能够有效分离出高质量的精子。通过在离心管中形成密度梯度，高质量的精子会通过梯度并形成底部的沉淀。这种方法已被证明能够提高精子的运动能力、形态正常性和DNA完整性，从而提升胚胎生产率。此外，密度梯度离心还能够去除某些病毒，如马病毒动脉炎（EVA）。

游泳法利用精子的自然运动能力，将高质量的精子从精液中分离出来。该方法通常需要较长的处理时间，但能够提供高运动能力的精子。然而，游泳法的筛选效率较低，且在某些情况下可能无法满足体外受精的需求。

微流控技术是一种新兴的筛选方法，利用微流体装置筛选出具有高运动能力和良好形态的精子。这种方法能够有效提高精子的筛选效率，并且在某些情况下，其筛选效果优于游泳法和密度梯度离心。然而，微流控技术需要较高的初始精子浓度和体积，这在使用切割精液时可能会成为限制因素。因此，一些研究建议在微流控筛选后进行离心处理，以提高精子的回收率。

### 6. 受精方法

在体外受精中，受精方法的选择对胚胎的形成至关重要。常见的受精方法包括ICSI和IVF。

ICSI是一种直接将单个精子注入卵子中的技术，适用于不育或精子供应有限的情况。该技术的成功率较高，但其操作过程较为复杂，需要高度精确的显微操作。研究表明，ICSI的成功率与种马的品种、年龄和精液质量密切相关。此外，ICSI过程中，精子的选择主要基于形态和运动能力，而DNA完整性则无法通过简单的显微观察确定。因此，ICSI的成功率可能受到精子筛选过程的影响。

IVF是一种更为传统的受精方法，精子与成熟卵子在体外共同培养，以自然方式完成受精。尽管IVF在早期阶段曾被认为难以实现，但近年来随着技术的进步，其成功率已显著提高。IVF的成功率与精子的保存方式密切相关，冷冻精子由于其较高的成熟度，能够在较短时间内完成受精过程。此外，IVF的成功率还受到精子数量的影响，通常需要较高的精子浓度以确保受精的成功。

### 7. 结论

综上所述，体外受精技术在马匹繁殖中的应用越来越广泛，其成功不仅依赖于种马和精子的质量，还受到精子处理、保存和筛选方法的影响。为了提高体外受精的成功率，需要综合考虑种马的品种、年龄和生育能力，以及精子的来源、保存方式和筛选技术。同时，兽医和实验室之间的密切合作对于优化IVP流程和提高胚胎生产率至关重要。随着技术的不断进步，未来体外受精将在马匹繁殖领域发挥更大的作用，为种马的管理和繁殖提供更加灵活和高效的解决方案。