在意大利东北部，产生K2-和OXA-48耐药性的肺炎克雷伯菌ST395的出现及其在医院间的传播

《Journal of Global Antimicrobial Resistance》：Emergence and inter-hospital circulation of capsule K2- and OXA-48-producing Klebsiella pneumoniae ST395 in North-Eastern Italy

本研究分析了2024年5月至7月在意大利威尼斯地区三家医院及社区采集的57株产OXA-48的ST395 Klebsiella pneumoniae的分子流行病学特征，发现其携带广泛耐药基因，并通过PFGE和WGS确定主要克隆亚型A3、A9和A12，提示医院和社区间存在交叉传播，需加强监测和防控。

　　### 引言

*克雷伯菌属*（*Klebsiella*）是一类常见的革兰氏阴性细菌，主要在医院环境中引起感染，但也可能在社区中引发某些感染，如肺炎、肝脓肿、尿路感染和血液感染。这些细菌因其能够获得并传播多种抗生素耐药性特征而广受关注，使其成为全球范围内多药耐药（MDR）病原体之一。除了耐药性，研究还表明，*克雷伯菌属*的某些菌株具有增强的致病性和毒力特征。多种基因与这种毒力有关，例如*iacA*（一种铁载体）、*iroB*（另一种铁载体）以及*rcpA*（一种调控多粘性表型的基因）。其中，荚膜类型（K型）被认为是高度致病性的重要标志，如K1、K2、K16、K28、K57和K63等。据黄等人研究，K1和K2型荚膜在所有由高毒力*克雷伯菌属*引起的感染中占70%的比例。因此，了解这些菌株的毒力特征对于预防和控制感染至关重要。

在意大利，传统的多药耐药*克雷伯菌属*主要由克隆复合体（CC）258主导，但近年来，国家的流行病学趋势发生了变化，出现了其他高风险的克隆，如ST101和ST307。而ST395这一国际性高风险克隆，其多药耐药性主要与ESβLs（扩展谱β-内酰胺酶）和碳青霉烯酶的产生有关。ST395克隆最早于2010年在法国的一家医院中被描述，当时发生了一起由OXA-48型碳青霉烯酶引起的*克雷伯菌属*爆发事件。此后，ST395型OXA-48产*克雷伯菌属*在荷兰和摩洛哥等地也引发了多起爆发，并在欧洲国家中偶有发现。意大利首次报告ST395型*克雷伯菌属*的时间可以追溯到2016年，当时在佛罗伦萨和卡塔尼亚发生了由KPC-3型耐药基因的*克雷伯菌属*引起的血流感染事件，而在锡耶纳和卡塔尼亚则发现了OXA-48型*克雷伯菌属*的ST395菌株。随后，2016年11月，意大利西西里岛的一家医院新生儿重症监护室发生了由KPC-3型*克雷伯菌属* ST395引起的爆发事件。

本研究旨在描述OXA-48型*克雷伯菌属* ST395在意大利东北部威尼斯省的逐渐增加和传播情况，并对涉及的菌株进行分子水平的表型和基因型分析。

### 材料与方法

#### 2.1 细菌鉴定和抗生素敏感性测试

在2024年5月至7月期间，从威尼斯省的三家医院及其周边社区共收集了57株OXA-48型*克雷伯菌属*菌株。这些菌株来自不同类型的临床样本，包括尿液、血液、伤口、支气管分泌物、咽拭子和肛拭子。所有菌株均通过VITEK? 2系统进行了细菌种类鉴定和抗生素敏感性测试。此外，使用Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry（MALDI-TOF MS）进一步确认了菌株的分类，并使用BioTyper版本3.0软件进行分析。抗生素敏感性结果按照欧洲抗菌药物敏感性测试委员会（EUCAST）2025年的标准进行解释。

为了检测碳青霉烯酶的产生，采用了CARBA PLUS（MASTGroup）和NG-Test? CARBA-5免疫测定法（NG Biotech Laboratories）。此外，使用E-test（bioMerieux）对头孢他啶（ETP）和美罗培南（MP）的最小抑菌浓度（MIC）进行了测定，以确认其耐药性。

#### 2.2 高毒力*克雷伯菌属*（HvKP）表型检测（String Test）

高毒力*克雷伯菌属*（HvKP）的诊断通过String Test进行。String Test是一种通过将细菌菌落拉伸在琼脂平板上，观察是否形成超过5毫米长的黏液条的检测方法。实验中使用了*Klebsiella quasipneumoniae* subsp. *similipneumoniae* F56作为阳性对照。

#### 2.3 红色 Congo 菌落培养法

所有菌株均在含0.08%（w/v）红色 Congo 和5%（w/v）蔗糖的脑心浸液琼脂（BHIA）上培养。培养后，生物膜形成菌株会在培养基上形成黑色菌落，而非生物膜形成菌株则形成红色菌落。同时，菌株在微需氧条件下也被培养，并在24小时和48小时后进行评估。*金黄色葡萄球菌* ATCC 25923被用作生物膜形成的阳性对照。

#### 2.4 脉冲场凝胶电泳（PFGE）

PFGE用于分析36株菌株的基因组相关性。菌株通过XbaI限制酶进行基因组DNA的切割，然后在CHEF DRII系统（Bio-Rad）上进行电泳。电泳后，使用Fingerprinting II版本3.0软件（Bio-Rad）通过UPGMA算法构建树状图，以评估菌株之间的相似性。Dice相关系数用于分析条带模式的相似性，并设定1.0%的位置容忍度。通过PFGE，检测到三种主要的脉冲型（A、B和C），其中脉冲型A包括12个亚型（A-A12）。

#### 2.5 短读长全基因组测序（WGS）

为了进一步研究菌株的分子特征，选择了7株代表性的菌株进行全基因组测序（WGS）。测序使用Illumina NovaSeq平台进行，250 bp的配对末端测序技术用于数据生成。测序前，使用DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen）提取基因组DNA。测序数据通过FastQC v0.11.9进行质量检查，并使用Shovill v1.1.0进行从头组装。手动注释通过Rapid Annotation using Subsystems Technology（RAST）服务器进行。为了分析耐药基因（resistome）、质粒特征（plasmidome）和毒力基因（virulome），使用ResFinder v4.5.0、PlasmidFinder 2.1和VFDB数据库（）通过ABRicate v1.0.0进行分析。多基因座序列分型（MLST）通过Klebsiella spp. Pasteur方案进行，并使用Institut Pasteur网站（）进行分析。毒力评分通过Kleborate v3.1.2进行计算。

#### 2.6 单核苷酸多态性（SNP）分析和系统发育重建

为了研究七个测序菌株与全球ST395型*克雷伯菌属*菌株的系统发育关系，使用Parsnp v1.2对这些菌株与239株ST395型*克雷伯菌属*基因组进行了SNP分析。使用FastBaps算法对基因组群体进行聚类分析。通过SNP矩阵，构建了系统发育树，并使用Interactive Tree of Life（iTOL）（）进行可视化。此外，通过snp-dists 0.7.0对菌株之间的SNP差异进行了计算。

#### 2.7 转座实验

为了测试碳青霉烯酶基因的可转移性，使用Mueller-Hinton（MH）培养基和*大肠杆菌* J53菌株（受体）进行转座实验。所有菌株在MH肉汤中过夜培养后，与处于早期稳定期的*大肠杆菌* J53菌株按1:10的比例混合，并在37°C下培养一夜。然后，将获得的转座子菌株在含利福平（100 mg/L）和氨苄西林（50 mg/L）的MacConkey琼脂平板上筛选和培养。

#### 2.8 图形展示

图形展示使用GraphPad Prism版本10.0.0进行。图1展示了不同脉冲型的传播情况。图2展示了七个测序菌株的毒力评分和耐药评分。图3为SNP矩阵的热图表示，展示了七个测序菌株与全球ST395型*克雷伯菌属*菌株的遗传距离。图4为七个测序菌株的氨基酸序列比对，显示了与参考OXA-48型碳青霉烯酶的相似性。

### 结果

#### 3.1 传播情况描述

从2024年5月20日到7月9日，意大利东北部威尼斯省的东部地区出现了OXA-48型*克雷伯菌属*的上升趋势。这些菌株主要来自三家医院及其周围的社区，这些社区位于同一市政区域。收集的样本来自非住院患者，他们前往医院的样本采集中心。根据记录，首个病例（P_8）发生在医院C的社区区域，来自尿液样本。在研究期间，共从57名患者中分离出57株OXA-48型*克雷伯菌属*菌株，这些菌株来自不同的临床样本，包括肛拭子（25/57）、尿液（19/57）、支气管分泌物（3/57）、血液（5/57）、咽拭子（2/57）和伤口（3/57）。其中，医院A的菌株数量最多（27/57），其次是医院B（19/57）和医院C（10/57）。在所有三个地理区域中，医学、康复和重症监护病房（ICU）是最常见的来源。患者的临床病史各不相同，包括医疗、外科和康复情况。一些患者从威尼斯省的其他医院或不同地区和省份的医院转移而来。值得一提的是，有一名患者来自德国，这与当地旅游的特殊性有关。此外，部分患者由于癌症或其他共病（如糖尿病和心脏疾病）导致免疫力低下。除了德国游客外，其他患者均未出国。在一些病例中，患者因非感染性原因死亡。大多数患者接受了多种抗生素治疗，如头孢曲松、头孢他啶-阿维巴坦和万古霉素，但也有部分患者在索引病例期间未接受任何抗生素治疗。

#### 3.2 抗生素和表型分析

抗生素敏感性测试显示，所有菌株对几乎所有药物均表现出广泛耐药（XDR）表型，除了氨基糖苷类和多粘菌素。此外，除了两株菌株外，所有菌株均对多粘菌素具有耐药性（MIC ≤0.5 mg/L）。碳青霉烯耐药机制被鉴定为OXA-48样酶的产生，这通过CARBA PLUS和NG-Test? CARBA-5免疫测定法得到了证实。String Test显示，所有菌株均未表现出高黏液性表型，而Congo红培养法表明这些菌株无法形成生物膜。*金黄色葡萄球菌* ATCC 25923被用作生物膜形成的阳性对照。

#### 3.3 基因组相关性

通过PFGE分析，检测到三种主要的脉冲型（A、B和C）。其中，脉冲型A是主要的脉冲型，进一步分为12个亚型（A-A12）。在数量上，亚型A3和A9（各8株）是主要的克隆，其次是A12（4株）、A5（3株）和A11（2株）。有趣的是，这些脉冲型在特定地理区域中表现出偏好性传播。例如，脉冲型A3主要在医院A中传播，而A3也在医院B和C中出现，但传播程度较低，被A9和A12所超越。脉冲型A9在医院B中未被检测到。这表明在特定的医院和社区环境中，ST395菌株的传播存在一定的区域性特征。

#### 3.4 基因组特征分析

全基因组测序结果显示，所有测序菌株均属于ST395型。这些菌株的耐药基因（resistome）包括多个共享的耐药基因，如氨基糖苷类（*aac(3)-IIa*, *aac(6′)-Ib-cr*）、氯霉素（*catA1*, *catB4*）、第三代β-内酰胺类（*bla*CTX-M-15）和碳青霉烯类（*bla*OXA-48）的耐药基因。除了P_2外，所有菌株均携带磺胺类（*sul-1*, *sul-2*）、四环素类（*tet(A)*）和甲氧苄啶（*drfA-1*）的耐药基因。P_2菌株缺少*aac(3)-IIa*和*catA1*基因。此外，P_5菌株的*bla*OXA-48基因缺失了119个核苷酸，导致其产生的酶仅由221个氨基酸组成，而非预期的265个氨基酸。尽管存在这种一致的改变，但缺失的核苷酸并不位于OXA-48酶的活性位点，因此该酶仍能保持其对碳青霉烯类抗生素的水解活性。通过MIC值的测定，验证了这一结论，其中ETP的MIC值≥8 mg/L，MP的MIC值≥32 mg/L。OXA-48在P_2中仍可通过CARBA PLUS和NG-Test? CARBA-5免疫测定法检测到。此外，所有菌株均携带*qacE*基因，这与耐消毒剂相关。

#### 3.5 系统发育相关性

通过SNP分析，构建了七个测序菌株与全球ST395型*克雷伯菌属*菌株的系统发育树。使用FastBaps算法对所有ST395型基因组进行了聚类分析，将ST395型基因组分为四个聚类（CL1-4）。这七个意大利菌株均落在CL3中，该聚类与较高的毒力负荷相关。SNP分析表明，所有七个测序菌株在同一个节点中聚集，该节点包括13个基因组。虽然七个测序菌株之间存在一定的系统发育关系（最大SNP差异为77），但只有P_16和P_60表现出克隆同一性（SNP差异为2）。在意大利亚群中，系统发育差异被描绘出来。例如，P_8（5月20日从医院C社区区域的尿液样本中分离）与P_59（6月26日从医院B的血液样本中分离）表现出较高的系统发育相似性（SNP差异为8）。此外，6月26日收集的四株菌株表现出较高的系统发育相似性（SNP差异≤12），除了P_59，其具有不同的进化路径（最大SNP差异为35）。P_5（7月3日从尿液样本中分离）是七个测序菌株中最远的系统发育关系（最大SNP差异为77），与P_55表现出较高的相似性（SNP差异为31）。这一意大利分支与两个在美国2021年收集的ST395型*克雷伯菌属*基因组（Pasteur ID “39999”和“40066”）表现出最高的系统发育相似性，这两个基因组均携带*bla*OXA-48型碳青霉烯酶基因。SNP矩阵的热图表示在图5C中展示。

### 讨论

ST395型*克雷伯菌属*是一种新兴的高风险克隆，促进了OXA-48型碳青霉烯酶基因在欧洲的传播。在意大利，ST395型*克雷伯菌属*主要与KPC-like基因的传播有关，尤其是在意大利中部和南部地区。相比之下，本研究描述了OXA-48型*克雷伯菌属* ST395和K2型荚膜在威尼斯省的增加和传播情况。这些菌株在医院和社区中均有发现，表明其传播范围广泛。此外，所有菌株均未表现出高黏液性表型，也未表现出生物膜形成能力。然而，其他不同的毒力特征，如铁载体、菌毛系统、T6SS系统和血清抵抗性，也被发现。值得注意的是，K2型荚膜在许多严重感染中被报道与致死性有关。例如，Yeh等人发现，K2型*克雷伯菌属*在小鼠感染中存活率为0%。K2型荚膜的毒力特征还包括对巨噬细胞和中性粒细胞吞噬作用的抵抗，这使其能够在免疫缺陷的宿主中引起严重感染。K2型荚膜的高毒力特征也通过Huang等人的小鼠败血症模型得到了验证，其中K2、K1和K20型荚膜在48小时内导致100%的死亡率。尽管已有文献表明K2型荚膜的致病性，但其毒力强度仍需进一步研究以明确其在临床中的实际影响。

在威尼斯省的医院和社区环境中，ST395型*克雷伯菌属*的传播表明需要特定的监测计划和医院环境的可能去污染措施。然而，除了P_2外，所有测序菌株均携带*qacE*基因，这些基因编码多种耐药的外排泵，使其能够抵抗多种消毒剂，包括季铵盐化合物（QACs）。QACs是医院环境中常用的消毒剂，因此*qacE*基因的存在可能导致这些菌株对QACs的耐受性增强，并表现出对某些抗生素的交叉耐药性。Muggeo等人发现，ST395型*克雷伯菌属*对氯己定（chlorexidine）的耐药性比ST147型更高，这进一步表明ST395型*克雷伯菌属*在威尼斯省的持久性。然而，这一推测尚未通过表达实验或特定MIC值的测定得到验证，因此需要进一步的研究。

### 结论

本研究报告了意大利东北部威尼斯省OXA-48型*克雷伯菌属* ST395和K2型荚膜的显著增加。通过传统和新一代分子技术，我们对在威尼斯省传播的这一菌株的群体结构进行了更精确的描述。然而，由于研究时间较短且测序菌株数量有限，尚无法准确确定这一增加的起始时间和是否有明确的爆发事件。因此，这一克隆需要进一步研究和监测，以限制其在威尼斯省的传播，并防止其在其他意大利地区扩散。

### 局限性

本研究的主要局限性在于研究时间较短，无法确定ST395型*克雷伯菌属*在威尼斯省的确切传播时间。此外，无法对整个社区群体进行更广泛的调查，也无法监测其他邻近医院中ST395型*克雷伯菌属*的存在。最后，部分患者的临床信息缺失，使得我们无法全面追踪该菌株的传播和流行病学特征。这一局限性不仅影响本研究，也影响了在地方和国家层面对这一高风险克隆的持续监测能力。

### 伦理声明

本研究是对人类样本中的细菌分离物进行的观察性研究，这些样本是作为常规医院护理的一部分收集的，并且使用匿名方式进行分析。因此，无需获得参与者的同意，因为样本是通过标准患者护理程序获得的。

### 兴趣冲突

本研究中没有利益冲突。

### 资金声明

本研究得到了欧盟资助，通过NextGenerationEU-MUR PNRR扩展合作伙伴计划支持（项目编号P E00000007, INF-ACT）。

### 人工智能工具的使用

本研究中未使用任何人工智能工具。

### 数据可用性

所有测序菌株的核苷酸序列已上传至NCBI数据库，生物项目编号为PRJNA1257561。