未经处理和处理后的废水中的微生物群与耐药基因组动态：一项为期十个月的研究，利用RNA探针捕获技术及亚种水平的宏基因组学进行分析

《Journal of Hazardous Materials》：Microbiota and Resistome Dynamics in Untreated and Treated Wastewater: A Ten-Month Study Leveraging RNA-Probe Capture and Subspecies-Level Metagenomics

本研究通过元基因组学方法，分析了挪威奥斯陆某污水处理厂未处理和处理的污水样本，发现污水处理显著减少人类肠道相关细菌和大肠杆菌数量，但某些耐药基因（如ESBLs、碳青霉烯酶）和耐药病原体亚型（如Kp SL12和Acinetobacter baumannii ST399）仍存在，靶向富集技术提高了低丰度耐药基因的检测灵敏度，表明污水处理未能完全消除耐药基因的传播风险。

　　本研究聚焦于挪威奥斯陆地区的市政和医院废水处理厂，通过采用宏基因组学方法，对未经处理的废水（UWW）和处理后的废水（TWW）中的微生物群落、抗性基因（ARGs）和可移动遗传元件（MGEs）的组成和动态变化进行了深入分析。该研究覆盖了为期十个月的时间跨度，旨在探讨废水处理过程对ARGs和潜在致病菌传播的影响，并评估不同方法在监测抗性基因方面的有效性。

研究结果显示，废水处理显著降低了与人类肠道相关的细菌种类的相对丰度和总载量，同时增加了环境细菌的种类比例。这一变化与ARGs和MGEs的相对丰度和多样性下降密切相关。然而，废水处理对某些关键AMR相关病原体的影响却表现出高度不一致性，表明尽管处理过程减少了整体的抗性基因负担，但某些特定病原体仍能在处理后的废水中保持较高的相对丰度。这提示我们需要更深入地关注这些病原体在废水处理过程中的行为特征，以及它们如何在处理后的废水中维持存在。

为了进一步分析这些病原体的亚种动态，研究采用了StrainGE工具，该工具能够从宏基因组中准确地进行菌株分型。结果表明，尽管废水处理对某些菌株造成了影响，但一些亚种仍然在UWW和TWW中持续存在。例如，检测到的某些大肠杆菌（E. coli）和肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）亚种在多个时间点中均被观察到，这表明它们可能在处理过程中具有较强的生存能力。此外，研究还发现某些ARGs在处理前后表现出显著的变化，包括某些原本未检测到的抗性基因在处理后被发现，而一些原本存在但处理后消失的基因则出现了相反的趋势。

研究还比较了不同方法在检测ARGs方面的效果。通过采用靶向RNA探针杂交富集技术，研究者发现这种方法在检测临床重要ARGs方面比传统 Shotgun宏基因组测序方法具有更高的灵敏度。尽管Shotgun宏基因组测序在检测ARGs时受到测序深度的限制，但靶向富集技术能够有效捕捉到那些低丰度的ARGs，包括那些与临床重要病原体相关的抗性基因。例如，研究发现多种与碳青霉烯类抗生素抗性相关的基因，如blaNDM-1、blaVIM-2和blaIMP，在靶向富集的样本中被成功检测到，而在Shotgun宏基因组测序中却未能识别。这表明靶向富集技术在废水抗性基因监测中具有独特的优势。

在宏基因组测序和靶向富集技术的基础上，研究还对ARGs的遗传背景进行了分析。例如，研究发现某些ARGs主要由质粒携带，而其他则与细菌染色体相关。这些ARGs的分布与特定细菌的宿主范围密切相关，进一步说明了ARGs在废水中的传播和转移机制。研究还指出，某些ARGs可能被非致病环境细菌天然携带，但它们对临床致病菌的传播风险较低，因为这些环境细菌的致病性较低，且它们的ARGs不容易通过水平基因转移（HGT）转移到致病菌中。

值得注意的是，尽管挪威的AMR流行率较低，但该研究仍然检测到了多种临床重要的ARGs，包括对氨基糖苷类、氟喹诺酮类、磺胺类、糖肽类、多粘菌素类等抗生素的抗性基因。这表明即使在AMR相对较低的环境中，废水仍可能成为ARGs传播的重要途径。同时，研究还发现某些ARGs在处理后的废水中仍然存在，这提示我们需要进一步优化废水处理技术，以更有效地减少这些抗性基因的排放。

研究还讨论了废水处理对微生物群落和ARGs分布的潜在影响。例如，废水处理过程中，一些与人类肠道相关的微生物被显著减少，而环境微生物则相对增加。这可能是由于处理过程改变了废水中的营养成分和氧气水平，从而影响了微生物的生存和繁殖。此外，研究还指出，某些ARGs在处理后的废水中表现出更高的丰度，这可能与处理过程中产生的选择压力有关，例如残留的抗生素或其他环境污染物可能促进了这些抗性基因的存活和传播。

在方法论方面，研究采用了多种技术手段，包括Shotgun宏基因组测序、靶向RNA探针杂交富集、StrainGE亚种分析以及16S rRNA基因信号的标准化。这些方法的结合使得研究能够更全面地了解ARGs的分布和动态变化。例如，通过将ARGs的丰度与16S rRNA基因信号进行标准化，研究者能够更准确地评估不同样本中ARGs的实际载量，而不仅仅是相对丰度。此外，研究还采用了Procrustes分析，以探索ARGs、微生物群落和MGEs之间的相互关系，进一步揭示了废水环境中这些元素之间的复杂互动。

研究还指出，尽管 Shotgun宏基因组测序在检测ARGs方面存在局限性，但结合靶向富集技术可以显著提高检测的灵敏度。例如，靶向富集技术能够检测到更多的ARGs，尤其是在那些低丰度但临床重要的抗性基因方面。这表明，单一的Shotgun宏基因组测序方法可能无法全面反映废水中的ARGs状况，而靶向富集技术则提供了更精确的检测手段。

研究的局限性在于，由于探针设计的限制，仅能靶向ARGs序列本身，而无法获取其周围的基因组信息。这在一定程度上限制了对ARGs遗传背景的深入分析。然而，靶向富集方法仍然具有显著优势，例如其能够覆盖更广泛的ARGs，并且在检测低丰度ARGs方面表现出更高的分辨率。此外，研究还指出，未来结合RNA探针富集和长读长测序技术可能会进一步提高ARGs的检测精度和遗传背景的解析能力。

研究的结论强调了宏基因组学在废水抗性基因监测中的重要性，特别是在结合靶向富集技术和亚种分析的情况下。这些方法不仅能够帮助我们更全面地了解废水中的ARGs分布，还能够识别高风险的病原体亚种，从而为抗性基因的传播和防控提供科学依据。同时，研究也指出，尽管废水处理能够减少部分ARGs的丰度，但某些ARGs和病原体仍然能够在处理后的废水中存活，这提示我们需要采取更加严格的废水处理措施，以确保环境中的抗性基因不会对公共健康造成威胁。

此外，研究还提到，欧洲联盟已经将废水抗性基因监测纳入其政策框架，这表明废水作为抗性基因传播的重要媒介，其监测和管理具有重要的公共卫生意义。在这一背景下，宏基因组学技术的应用为实现更有效的抗性基因监测提供了新的工具。同时，研究也强调了在废水抗性基因监测中，需要结合多种技术手段，以全面评估抗性基因的分布和动态变化。

最后，研究指出，尽管在某些情况下，废水处理可能未能完全消除抗性基因的传播，但在整体上，废水处理显著降低了抗性基因的相对丰度和多样性。这一发现对于制定更加有效的抗性基因防控策略具有重要意义。此外，研究还建议，在未来的废水抗性基因监测中，应更加关注某些高风险的ARGs和病原体亚种，以更好地评估它们对公共健康的潜在威胁。