通过冷等离子体处理验证食品源性病原菌大肠杆菌外膜破坏的协同作用（包括细胞外和细胞内机制）

《Journal of Hazardous Materials》：Synergistic Extracellular and Intracellular Actions for Verifying the Disruption of Outer Membrane of Foodborne Pathogen Escherichia coli via Cold Plasma Treatment

冷等离子体通过破坏大肠杆菌外膜脂多糖修饰和蛋白转运机制，引发不可逆结构解体，协同胞内氧化应激导致微生物灭活。

　　

刘梦媛|杨晓|凯文·M·基纳|程俊虎

华南理工大学食品科学与工程学院，中国广州510641

摘要

冷等离子体技术在微生物去污方面展现出巨大潜力。然而，由于其复杂的活性物种化学性质和多方面的细胞靶点，其具体作用机制仍不清楚。先前的研究表明，冷等离子体对革兰氏阴性细菌具有更强的抗菌效果，这可能归因于它们独特的外膜结构。本研究全面评估了冷等离子体对大肠杆菌（Escherichia coli）外膜生物物理性质和生化组成的影响，并结合转录组分析来阐明相关途径的响应。直接暴露于等离子体会立即导致外膜损伤，表现为通透性增加、机械完整性受损、化学成分改变以及大量成分丢失。关键的是，本研究首次发现了冷等离子体对外膜重塑和修复过程的重要干扰，包括脂质A生物合成受到抑制、脂多糖修饰受损以及外膜蛋白运输机制功能失调。细胞外损伤与细胞内应激之间的动态相互作用共同导致了不可逆的外膜解体。这些发现加深了人们对冷等离子体与微生物相互作用的理解，并为下一代基于冷等离子体的抗菌技术提供了战略性的见解。

引言

确保饮用水和食品系统中的微生物安全是一个持续的全球公共卫生挑战。冷等离子体技术因其高效性、广谱活性和环境兼容性而在这一应用中展现出巨大潜力[39][42][43]。微生物的失活主要源于等离子体激发过程中产生的活性物种，包括短寿命的·OH、1O?、·O??和·NO，以及长寿命的O?、H?O?、NO??和NO??[20]。其中，·OH和1O?主要破坏微生物的外膜结构，而其他活性氧和氮物种则能穿透细胞膜，引发细胞内的氧化反应并导致后续的生化变化[38]。然而，由于细胞结构、抗氧化防御和修复系统的差异，微生物对冷等离子体的反应存在显著差异。先前的研究表明，冷等离子体对革兰氏阴性细菌的杀菌效果优于革兰氏阳性细菌，两者之间的失活途径也有所不同：革兰氏阴性细菌在冷等离子体处理后通常会出现严重的外膜损伤，而革兰氏阳性细菌则几乎没有形态变化[16][9]。这种高效的结构破坏机制非常重要，因为它能显著减少亚致死损伤（SLI）和存活但无法培养（VBNC）细菌的数量[39][42][43]，从而大大降低了这些细菌复苏和增殖的潜在威胁。

革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌之间的关键结构差异在于它们的细胞壁组成。革兰氏阳性细菌具有坚固的多层肽聚糖细胞壁，而革兰氏阴性细菌则具有异常薄的一层肽聚糖，并且具有一层独特的外膜（OM）。该外膜由外层的脂多糖（LPS）、内层的磷脂以及嵌入其中的膜蛋白（OMPs）组成[30]。虽然冷等离子体处理会损害外膜和内膜的完整性，但我们的先前研究表明，革兰氏阴性细菌的外膜裂解 specifically 发生在外膜[39][42][43]。因此，我们假设革兰氏阴性细菌在冷等离子体作用下出现的严重损伤与其外膜的脆弱性有关。因此，有效破坏外膜是冷等离子体介导的革兰氏阴性细菌失活途径的关键步骤。

值得注意的是，在许多消毒方法中，外膜起着重要的屏障作用。LPS分子在外层紧密排列，构成了外膜结构的基础。这种稳定性大大限制了化学消毒剂和电穿孔对外膜的破坏效果[4][46]。此外，革兰氏阴性细菌拥有复杂的应激响应系统，能够持续监测外膜的完整性。一旦检测到损伤信号，该系统会迅速启动适应性转录程序以促进修复[23]。同时，细菌可以通过修改LPS来动态调节外膜的电荷和流动性，从而适应环境压力[31]。与这些响应机制相关的基因表达变化被认为是革兰氏阴性细菌对抗菌剂（如银纳米颗粒和氯）产生耐受性的关键因素[33][5]。

基于这些分析基础，选择大肠杆菌（Escherichia coli）作为模型生物，系统地研究了冷等离子体处理对外膜通透性、机械完整性和生化组成的影响。进一步结合转录组分析，阐明了与外膜稳态相关的途径级响应。本研究全面揭示了细胞外-细胞内协同应激介导的外膜破坏机制，深入探讨了冷等离子体对微生物作用的关键方面。

实验部分

细菌样本制备

大肠杆菌（ATCC 35150）由广东省微生物保藏中心（GDMCC）提供。该菌株在37°C恒温摇床中以180 rpm的速度培养，直至OD???达到0.7。随后通过8,000 rpm、10分钟的离心分离细菌，并用0.01 M PBS进行三次洗涤。

冷等离子体处理系统

冷等离子体是通过之前描述的介电屏障放电（DBD）系统产生的[40][41]。操作参数包括15 kV的电压。

外膜通透性分析

首先通过测量细菌对NPN的吸收能力来评估冷等离子体处理对外膜通透性的影响。NPN是一种荧光染料，无法穿过正常的外膜。外膜通透性的增加使NPN能够进入大肠杆菌内部的疏水环境并发出荧光[7]。选择常用的外膜破坏剂PMB（多粘菌素E）作为阳性对照[21]。结果表明，冷等离子体处理显著

结论

基于冷等离子体对革兰氏阴性细菌的强效杀菌效果和结构破坏特性，我们重点研究了其独特的外膜结构，以系统地探讨等离子体对外膜这一主要屏障的破坏机制。我们的机制分析表明，冷等离子体直接作用于外膜，导致其通透性增加、机械完整性受损和成分改变。

环境影响

由于革兰氏阴性细菌具有独特的外膜结构，许多去污方法的效果有限，从而对食品安全构成潜在威胁。作为一种新兴的去污技术，冷等离子体对革兰氏阴性细菌的杀菌效率更高。本研究表明，这种增强效果与外膜的有效破坏有关。此外，从细胞和分子层面进行的进一步研究也证实了这一点。

作者贡献声明

刘梦媛：撰写初稿、验证、方法学设计、实验实施。杨晓：软件使用、资源获取、方法学设计、数据整理。凯文·M·基纳：验证、方法学设计、概念构思。程俊虎：撰写修订稿、监督工作、项目管理、资金申请、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（32272466, U23A20267）的支持。本研究还得到了广东省基础与应用基础研究基金（2024A1515011498）、广东省科技创新杰出青年人才计划（NYQN2024003）和TCL青年学者基金的支持。