来自Yersinia ruckeri YRB的儿茶酚铁载体周质结合蛋白RupB和YiuA的基底灵活性

《Journal of Inorganic Biochemistry》：Substrate flexibility of the catechol siderophore periplasmic binding proteins, RupB and YiuA from Yersinia ruckeri YRB

Yersinia ruckeri产生铁载体ruckerbactin及其水解产物，但主要周质结合蛋白RupB和YiuA的特异性研究显示RupB意外结合非自产enterobactin，而YiuA对多种单猫双酚铁载体（含L/D-Arg、L/D-Lys、L/D-Orn）展现广泛结合能力，影响铁载体chiral构型。

　　

埃米尔·汤姆森（Emil Thomsen）| 帕克·R·斯托（Parker R. Stow）| 玛伦·库科尔（Maren Cukor）| 艾莉森·巴特勒（Alison Butler）

美国加利福尼亚大学化学与生物化学系，圣巴巴拉，CA 93106

摘要

细菌通常会产生铁载体（siderophores）——这些小分子对Fe(III)具有高亲和力——以获取其生长所需的铁。在Fe(III)铁载体穿过革兰氏阴性细菌的外膜后，一种周质结合蛋白（PBP）通常会将其转运到内膜。鱼类病原体Yersinia ruckeri会合成寡酯三儿茶酚铁载体ruckerbactin（DHB-^LArg-^LSer)₃（1），在感染过程中利用这种铁载体来获取铁。其生物合成基因簇编码一种名为RupB的PBP，最初认为该蛋白能够结合Fe(III)ruckerbactin，但后来的荧光猝灭滴定实验表明，RupB并不能以生物学上显著的亲和力结合Fe(III)ruckerbactin或其水解产物（即双儿茶酚铁载体2和单儿茶酚铁载体3）。实际上，RupB结合的是结构相关的铁载体enterobactin（DHB-^LSer)₃，这令人惊讶，因为Y. ruckeri并不合成enterobactin。RupB在结合时会将Δ-Fe(III)-enterobactin的手性从顺式（cis）转变为反式（trans）。另一种PBP YiuA则编码在基因组的另一位置，它能以纳摩尔级的亲和力结合单儿茶酚铁载体DHB-^LArg-^LSer（3）的Fe(III)-(3)₂复合物以及二异构体Fe(III)-(4)₂复合物（其中4是单儿茶酚DHB-^DArg-^LSer）。我们的研究表明，YiuA也能识别含有其他阳离子氨基酸（如Lys、Orn）的类似铁载体结构）。

引言

细菌生长需要铁，但在有氧条件下和中性pH值下，水中的Fe(III)复合物会水解并沉淀[1]，这限制了铁的生物可利用性。为了获取铁，许多细菌会产生并排出铁载体，这些铁载体对Fe(III)具有高亲和力和选择性。Yersinia ruckeri会产生三儿茶酚铁载体ruckerbactin（DHB-^LArg-^LSer)₃的三丝氨酸酯，以及双儿茶酚铁载体di-(DHB-^LArg-^LSer）（2）和单儿茶酚铁载体DHB-^LArg-^LSer（3）（图1）。其中DHB是2,3-二羟基苯胺[2]。Y. ruckeri是鲑鱼类的病原体，会导致肠红口病，在水产养殖中造成严重的生态和经济问题[3]。基因敲除实验表明，当该菌无法产生ruckerbactin化合物（1-3）时，其LD_{50值增加了100倍，这突显了铁载体在Y. ruckeri感染宿主过程中的关键作用[4]。}

ruckerbactin属于儿茶酚铁载体家族，这类铁载体的结构都以L-Ser为核心，不同之处在于连接L-Ser和DHB的阳离子氨基酸（CAA）的种类和手性（图S1）。结构相关的铁载体还包括trivanchrobactin（含有D-Arg[5]）、cyclic-trichrysobactin（含有D-Lys[6]）、frederiksenibactin（含有L-Lys[7]）、turnerbactin（含有L-Orn[8]）以及mediterraneabactin（含有D-Orn[9]（图S1））。值得注意的是，双儿茶酚铁载体（2；图1）和单儿茶酚铁载体（3-8；图1）也是与其对应的三儿茶酚铁载体一起被分离出来的（图S1）。

迄今为止，已知能够合成含CAA的三儿茶酚铁载体的细菌均为革兰氏阴性菌，这些细菌通过特定的TonB依赖性外膜受体（OMR）蛋白识别并转运Fe(III)铁载体[10,11]。后续的转运过程因铁载体和细菌种类而异。一般来说，周质结合蛋白（PBP）[12]会将铁载体复合物转运到内膜的ABC转运蛋白[13]，后者再将其转运到细胞质中。转运蛋白对铁载体的具体结构特征（如类型、手性和多齿性）具有选择性[14, [15], [16], [17]]。

我们最近发现Yersinia ruckeri的周质结合蛋白YiuA对ruckerbactin水解产物Fe(III)-[DHB-^LArg-^LSer]₂具有前所未有的选择性。本文还研究了YiuA对含有L-和D-Orn以及L-和D-Lys的单儿茶酚铁载体Fe(III)复合物的适应性。此外，我们还确定RupB的真正底物是Fe(III)-enterobactin，这一发现令人意外，因为Y. ruckeri并不合成enterobactin。这些发现表明Y. ruckeri可以利用多种外源性铁载体，这可能有助于其在缺铁条件下的生存能力。

一般程序

纯净水来自Milli-Q IQ 7000净水系统（电阻率为18.2 MΩ）。ECD光谱是在Jasco J-1500仪器上记录的。UV-Vis光谱是在Cary 300 Agilent分光光度计上进行的。NMR光谱是在配备CryoProbe Prodigy BBO探头的Bruker Avance NEO 500 MHz仪器上采集的。用于生化表征的FeCl₃储备溶液是在50 mM HCl中制备的，并通过羟胺还原法进行定量。

YiuA：一种对(DHB-^L/DCAA-^LSer)铁载体Fe(III)复合物具有选择性的灵活周质结合蛋白

我们之前已经确定YiuA（Y. ruckeri YRB）的底物是Fe(III)与(DHB-^L/DLys)和(L/D^LOrn)组成的1:2复合物[18]。通过用含有D和L阳离子氨基酸的Fe(III)单儿茶酚铁载体复合物进行滴定实验，我们测定了YiuA的底物适应性（表1和图S2）。YiuA与 Fe(III)铁载体的结合常数K_d表明，该蛋白对这些底物具有最高的亲和力。

结论

本研究进一步探讨了鱼类病原体Y. ruckeri中的两种周质结合蛋白RupB和YiuA的特异性，包括它们对底物适应性的影响以及对Fe(III)手性的作用。先前的研究表明，RupB竟然无法以生物学上显著的亲和力结合任何Fe(III)ruckerbactin铁载体（1-3）[18]。本研究表明，Fe(III)-enterobactin才是RupB的底物。

CRediT作者贡献声明

埃米尔·汤姆森（Emil Thomsen）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学研究，数据分析，概念构建。帕克·R·斯托（Parker R. Stow）：撰写 – 审稿与编辑，方法学研究，实验设计。玛伦·库科尔（Maren Cukor）：实验设计。艾莉森·巴特勒（Alison Butler）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，资金获取，数据分析，概念构建。

利益冲突声明

作者声明以下可能的财务利益或个人关系可能构成利益冲突：（艾莉森·巴特勒表示她获得了美国国家科学基金会的财政支持。我是Elsevier《无机生物化学杂志》的编委会成员。如果还有其他作者，他们也声明自己没有可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

非常感谢美国国家科学基金会（CHE-2108596（AB）的资助。