卟啉的分泌并不会改变非结核分枝杆菌中的血红素生物合成过程

《Journal of Inorganic Biochemistry》：Porphyrin secretion does not alter heme biosynthesis in the nontuberculous mycobacteria

非结核分枝杆菌分泌的卟啉水平与血红素含量无直接关联，支持其血红素合成途径存在多级调控模型，为光动力疗法干预NTM感染提供新思路。

　　

王Grace|萨穆迪奥Jessica|阿夫塔布Hadia|莉莉Le|赞达克里米Fereshteh|多尼根Rebecca K.

美国哥伦比亚大学巴纳德学院化学系，纽约州纽约市10027

摘要

Mycobacterium smegmatis和M. abscessus在整个生长过程中都会分泌卟啉，其他一些细菌种类也被证明能够分泌卟啉，但具体效果各不相同。然而，血红素前体的分泌如何影响血红素水平目前尚不清楚。本研究发现，这两种分枝杆菌中的卟啉水平与血红素水平是相互独立的，因为细胞内或细胞外的卟啉增加并不会改变细胞内的血红素水平。我们的研究结果支持了一种具有多个调控点的血红素生物合成模型，进一步加深了我们对分枝杆菌内源性卟啉分泌和积累机制的理解，并表明分枝杆菌分泌卟啉具有生物学意义。

引言

非结核分枝杆菌（NTM）包括一百多种不属于Mycobacterium tuberculosis复合群或M. leprae的分枝杆菌[1]。这些细菌在自然环境中普遍存在，常存在于土壤或水中，在人造环境中也很常见，美国约80%的市政供水系统中都含有NTM[2]。某些NTM物种是机会性病原体，可感染免疫系统受损的个体，这类感染通常是由于环境暴露引起的[3]。NTM引起的皮肤和软组织感染较为常见，治疗这类感染通常需要数月的抗生素治疗，但效果往往不佳，因此亟需更好的治疗方案[4]。

与其他革兰氏阳性细菌一样，NTM通过依赖辅酶钴的途径（CPD）合成血红素（图1）[5,6]。该途径从5-氨基乙酰丙酸（ALA）到辅酶钴前体III（copro'gen）的步骤与大多数革兰氏阴性细菌和真核生物使用的经典原卟啉依赖性血红素生物合成途径是共同的[6]。在NTM中，从ALA到尿卟啉前体III（uro'gen）的步骤也与钴胺素和铁卟啉的生物合成途径有共同之处[6]。通过CPD途径合成血红素时，辅酶钴前体首先被氧化为辅酶钴III（copro），随后铁原子被插入形成铁卟啉（coproheme），最后经过两次连续的氧化脱羧反应生成血红素（heme）。CPD途径中的血红素中间体copro和coproheme（铁-辅酶钴III）在原卟啉依赖性途径中并未被利用，而这些中间体在CPD途径之外也具有生物学功能。例如，coproheme是一些细菌和古菌将铁卟啉转化为血红素过程中的中间体[6]，并且在Desulfovibrio desulfuricans的细菌铁蛋白中，它作为辅因子代替了传统的血红素b[7]。除了作为血红素生物合成中间体外，copro还具有多种其他功能：一些细菌和古菌利用它来螯合金属[8]，[9]，[10]，[11]，[12]，[13]。在NTM中的M. smegmatis（Msm）中，发现copro在休眠状态下也会被分泌[12]，我们的实验室还发现Msm和机会性病原体M. abscessus（Mabs）在多种培养基中都能分泌卟啉[14]。研究卟啉的分泌和积累过程具有重要意义，因为卟啉可用作光动力疗法（PDT）的光敏剂[4,15]，了解如何提高NTM中的内源性卟啉水平可能有助于PDT治疗NTM引起的皮肤感染。目前仍需明确NTM分泌卟啉的原因、如何调节其分泌和积累过程，以及这种血红素中间体如何影响NTM中的血红素水平。

在这项研究中，我们分析了Msm和Mabs的卟啉分泌情况，以探讨NTM分泌卟啉的生物学作用。我们发现了多种能够增加细胞内或细胞外卟啉水平的条件，但发现卟啉水平的变化与Msm或Mabs中的血红素水平变化并无关联。我们的研究结果支持NTM分泌卟啉具有生物学意义，并加深了我们对NTM血红素生物合成调控机制的理解。

实验方法

M. smegmatis和M. abscessus的生长

野生型Msm菌株mc²155和Mabs菌株ATCC 19977最初来自美国典型培养物收藏中心（ATCC）。细胞从甘油储备液中培养，置于37°C的摇床中，使用添加了0.05% Tween-80、0.5%甘油、5 g/L牛血清白蛋白（BSA）、2 g/L d-葡萄糖和0.85 g/L氯化钠的7H9培养基（称为7H9 complete）培养两天。对于不添加BSA或Tween的7H9培养基（文中称为7H9），则在7H9培养基中额外添加0.5%的...

M. smegmatis和M. abscessus在整个生长过程中都会分泌卟啉

从在7H9培养基中培养5天的Msm和Mabs的废培养基中提取了细胞外卟啉。通过LC-MS检测了每种菌株三个重复样本中的尿卟啉III和辅酶钴的存在。所有三个重复样本中均检测到了Msm和Mabs的辅酶钴（图S1）。这些数据以及之前关于Msm和其他细菌的研究[8]，[9]，[10]，[11]，[13]均强烈支持辅酶钴是所有研究中检测到的卟啉。然而，我们仍不能完全排除...

讨论

多种细菌会分泌卟啉，但其目的各不相同。Cutibacterium acnes（以前称为Propionibacterium acnes）分泌的辅酶钴可以改变Staphylococcus aureus的生物膜形成[11]，并影响先天免疫反应[13]。Glutamicibacter arilaitensis分泌辅酶钴以在微生物群落中螯合Zn²⁺[10]。此外，一些细菌需要辅酶钴或Zn-辅酶钴作为生长因子，这表明这些分子在细菌群落中具有互利作用[8]。然而...

结论

总之，我们发现NTM中的卟啉合成和分泌与血红素生物合成过程并非耦合，这支持了一种具有多个调控点的血红素生物合成调控模型。此外，Msm和Mabs在卟啉和血红素生物合成方面存在一些共同的调控机制。不过，我们的数据也表明，不同物种在卟啉分泌方面具有特定的调控机制和不同的生物学功能。

缩写说明

ALA
5-氨基乙酰丙酸
BSA
牛血清白蛋白
copro
辅酶钴III
辅酶钴前体
CPD
依赖辅酶钴的途径
CpfC
辅酶钴铁螯合酶
EC
细胞外卟啉
GsaM
谷氨酸半醛氨基转移酶
GtrR
谷氨酰-tRNA还原酶
H
细胞内血红素
HSA
人血清白蛋白
IC
细胞内卟啉
Mabs
Mycobacterium abscessus
Msm
Mycobacterium smegmatis
NTM
非结核分枝杆菌
PbgS
卟啉胆色素原合成酶
PDT
光动力疗法
SEC
尺寸排阻色谱
uro'gen

CRediT作者贡献声明

王Grace：实验设计、数据分析。萨穆迪奥Jessica：实验设计。阿夫塔布Hadia：实验设计。莉莉Le：实验设计、审稿与编辑、数据分析、概念构思。多尼根Rebecca K.：论文撰写、审稿与编辑、初稿撰写、监督、项目资助、数据分析、数据管理、概念构思。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究由Burroughs Wellcome基金在Scientific Interface项目（G-1021873.01）资助，资助者为R.K.D。

所有列出的作者均已批准该手稿，没有其他符合作者资格的人士。