DNA与RNA宏基因组下一代测序技术在下呼吸道感染病原体检测中的比较研究

《Journal of Infection》：A Comparative Study of DNA- and RNA-Metagenomic Next-Generation Sequencing for Pathogen Detection in Lower Respiratory Tract Infections

下呼吸道感染中DNA与RNA宏基因组测序的临床效能对比，发现RNA-mNGS在病原体检测精度（F1值0.80 vs 0.67）和特异性（98.6%）上显著优于DNA-mNGS，尤其在RNA病毒检测（97.5%灵敏度）方面具有独特优势，而DNA-mNGS对低丰度病原体（如细菌、真菌）的敏感性更高。流程优化（均质化或测序深度增加）未显著改善RNA-mNGS性能。

　　### 下呼吸道感染中DNA与RNA宏基因组测序的临床价值比较

下呼吸道感染（LRTI）是全球范围内导致死亡的重要原因之一，同时也消耗了大量的医疗资源。这类感染通常由多种微生物引起，包括细菌、真菌、病毒以及非典型病原体。因此，快速且准确地识别病原体对于临床治疗和预后至关重要。然而，传统的微生物培养方法存在耗时、难以检测某些难以培养的病原体等局限性。随着宏基因组下一代测序（mNGS）技术的发展，这种检测方式为病原体识别提供了新的可能，能够实现对多种微生物的无偏检测。

mNGS主要分为两种类型：宏基因组DNA测序（DNA-mNGS）和宏基因组RNA测序（RNA-mNGS）。DNA-mNGS通过检测样本中的所有DNA来源的遗传物质来识别微生物，而RNA-mNGS则专注于RNA转录物，具有降低宿主背景信号、提供转录活性信息以及能够检测DNA-mNGS无法识别的RNA病毒等优势。然而，由于RNA的不稳定性，RNA-mNGS在实际应用中面临诸多挑战，例如病原体检测失败的风险、样本处理和测序深度的技术差异等。

本研究旨在比较DNA-mNGS和RNA-mNGS在下呼吸道感染中的临床效用，并评估优化RNA-mNGS性能的策略。通过回顾性分析82名疑似下呼吸道感染患者的样本，同时进行DNA-mNGS和RNA-mNGS检测，并结合传统的微生物学检测（CMTs），研究者评估了这两种技术在识别致病微生物方面的表现。研究发现，DNA-mNGS和RNA-mNGS在整体一致性方面表现较差，但RNA-mNGS在识别致病微生物的精确度和F1评分上显著优于DNA-mNGS。此外，RNA-mNGS在检测RNA病毒方面具有明显优势，而DNA-mNGS则在细菌、真菌和非典型病原体的检测中表现更为敏感。

研究进一步探讨了RNA-mNGS流程优化对病原体检测的影响。通过使用模拟样本，研究者评估了不同处理方法和测序深度对病原体检测性能的影响。结果显示，增加测序深度或样本均质化并未显著提高RNA-mNGS对关键病原体（如肺炎克雷伯菌或曲霉菌）的检测敏感度。这表明，尽管RNA-mNGS在某些方面具有优势，但在低丰度病原体的检测上仍存在局限。

### 临床和模拟样本中的病原体检测表现

在临床样本中，DNA-mNGS和RNA-mNGS检测到了196种微生物，其中细菌占主导地位（93种），其次是真菌（33种）、病毒（68种）和非典型病原体（2种）。研究发现，RNA-mNGS在识别RNA病毒方面的表现尤为突出，检测到了97.5%的RNA病毒分离株，而DNA-mNGS在DNA病毒和非典型病原体的检测中更为敏感。然而，对于细菌和真菌的检测，RNA-mNGS的敏感度较低，尤其是对于低丰度的真菌如曲霉菌，尽管临床确认感染，但RNA-mNGS的检测结果却常常为阴性。

在分析致病微生物的检测表现时，RNA-mNGS展示了更高的精确度和阳性预测值（PPV），这有助于减少误诊的风险。相比之下，DNA-mNGS在真菌和非典型病原体的检测中表现出更高的敏感度，有助于避免漏诊。然而，研究也指出，RNA-mNGS在某些情况下可能无法检测到低丰度的病原体，这提示需要结合其他检测方法以提高检测的全面性。

### RNA-mNGS流程优化的探索

为了优化RNA-mNGS的检测性能，研究者在模拟样本中尝试了不同的处理方法和测序深度。模拟样本由三种浓度梯度（102、103和10? CFU/mL）的病原体（包括两种真菌和三种细菌）制备而成，并在不同处理条件下进行检测。结果显示，均质化处理对某些病原体（如曲霉菌和肺炎克雷伯菌）的RNA检测效果有限，这可能与这些病原体的细胞壁结构有关。此外，增加测序深度并未显著提升RNA-mNGS的检测性能，这表明在当前的实验条件下，优化RNA-mNGS的检测效果可能需要其他策略，如针对特定病原体的靶向检测或改进裂解方法。

### 临床意义与未来方向

尽管DNA-mNGS和RNA-mNGS在整体一致性方面表现不佳，但在识别致病微生物时，两者在高丰度病原体上的检测结果具有较高的相关性。RNA-mNGS在高丰度病原体上的表现优于DNA-mNGS，尤其是在减少误诊和提供RNA病毒检测方面。然而，对于低丰度病原体，这两种技术都存在一定的局限性，这可能需要结合传统的微生物学检测方法（CMTs）来弥补。

研究还指出，虽然RNA-mNGS在某些情况下表现优异，但其检测性能仍受到多种因素的影响，包括病原体的转录活性、样本处理技术以及参考数据库的完整性。因此，未来的研究应关注如何通过改进这些方面来提高RNA-mNGS的检测能力。此外，针对特定病原体的靶向检测策略、改进裂解方法以及优化测序流程，都是值得进一步探索的方向。

### 结论与展望

综上所述，RNA-mNGS在下呼吸道感染的病原体检测中具有重要的临床价值，尤其是在识别RNA病毒和减少误诊方面。然而，其在低丰度病原体的检测上仍存在不足，因此在实际应用中，可能需要结合DNA-mNGS和其他检测手段，以实现更全面的病原体识别。此外，针对不同病原体的特性，优化RNA-mNGS的检测流程和方法，将是未来提升该技术临床效用的关键。随着技术的不断进步和研究的深入，mNGS有望在临床诊断中发挥更大的作用，为下呼吸道感染的病原体识别提供更加准确和全面的信息。