一种基于创新核抗原的方法，用于分离肾上腺皮质癌患者循环中的肿瘤细胞（单细胞水平）

《Journal of Liver Transplantation》：An Innovative Nuclear Antigen-Based Approach for Single-Cell Isolation of Circulating Tumor Cells in Adrenal Cortical Carcinoma

肾上腺皮质癌（ACC）是一种罕见且侵袭性强的肿瘤，其循环肿瘤细胞（CTC）的检测对早期诊断和监测微小残留疾病至关重要。本研究提出了一种新型CTC检测方法，结合Parsortix?系统进行大小和机械特性富集，并通过DEPArray?技术利用核标志物SF1免疫荧光染色进行单细胞分离。该方法克服了传统膜过滤技术依赖表面标记（如EpCAM和细胞角蛋白）的局限性，首次实现了基于核抗原的ACC CTC特异性捕获，并通过低通全基因组测序验证了单细胞CNA分析的可行性。研究为ACC液体活检提供了标准化单细胞分析策略，并探讨了其在术后监测和化疗响应评估中的应用潜力。

　　腺瘤性皮质癌（Adrenal Cortical Carcinoma, ACC）是一种罕见且具有侵袭性的内分泌肿瘤，其起源于肾上腺皮质。由于ACC的临床表现和生物学特性较为复杂，治疗手段相对有限，因此对于早期诊断、监测残留病灶以及评估化疗效果的可靠生物标志物的需求尤为迫切。目前，对于ACC患者而言，根治性手术切除仍然是最有效的治疗方法，因为一旦在诊断时发现转移，患者的生存率会显著下降。因此，开发一种能够在血液中有效检测和分析循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells, CTCs）的方法，对于改善ACC患者的临床管理具有重要意义。

在本研究中，研究人员提出了一种新的方法，用于特异性、可重复地检测和分析ACC患者的单个CTCs。该方法结合了基于细胞大小和机械特性的Parsortix?系统进行CTC富集，以及通过DEPArray?技术进行单细胞免疫荧光检测和分离，针对肾上腺皮质特异性核标志物——类固醇生成因子1（Steroidogenic Factor-1, SF1）。这种方法突破了传统依赖于细胞膜表面标记物（如上皮细胞粘附分子EpCAM或角蛋白）的局限性，首次在悬浮状态下利用核抗原进行CTC的免疫细胞化学识别。通过利用CTCs较大的细胞核和较高的核质比这一特征，该方法为缺乏特异性表面标记物的肿瘤提供了更标准化的单细胞分离策略。

目前，许多用于检测CTCs的方法仍然存在一些挑战。例如，基于膜过滤的CTC富集技术虽然能够通过细胞大小差异筛选出潜在的CTCs，但这些方法往往技术复杂，容易引入分析偏差，并且缺乏标准化。此外，由于CTCs在过滤过程中可能粘附于膜表面，导致难以以单细胞形式进行后续的分子分析，从而限制了其在临床中的应用。为了克服这些问题，研究人员开发了一种结合大小筛选和免疫荧光标记的新流程，以提高CTC分离的准确性和可靠性。

研究团队首先通过实验验证了这种方法的有效性。他们将H295R细胞（一种常用于模拟ACC的细胞系）加入健康志愿者的血液样本中，然后使用Parsortix?系统进行富集。富集后的细胞样本经过固定和双色免疫荧光染色，分别使用针对SF1和CD45的抗体来标记CTCs和白细胞。通过DEPArray?技术，这些细胞能够在不同的荧光通道中被识别和分离。结果显示，该方法能够成功地从血液中富集并分离出CTCs，且其回收效率达到了12%，与之前使用EpCAM标记物的实验结果相似。

在实际应用中，研究人员将这一方法应用于5名ACC患者的血液样本，这些患者的临床特征包括不同的肿瘤分期和大小。结果显示，所有患者的样本均检测到了CTCs，并且在至少一个ScreenCell?滤膜中得到了确认。此外，研究还发现了CTC簇（CTMs），这些簇通常由CTCs和其他细胞组成，可能是肿瘤转移过程中形成的结构。通过这种方法，研究人员不仅能够识别出单个CTCs，还能够对其进行基因组层面的分析，包括拷贝数变异（Copy Number Alteration, CNA）研究。

研究团队进一步利用低通量全基因组测序（Low-pass Whole Genome Sequencing, WGS）对分离出的CTCs进行了分析。通过WGA（全基因组扩增）技术，研究人员成功地对单个CTCs和H295R细胞进行了扩增，并利用EASI-Genomics欧洲联盟资助的基础设施项目进行了后续的测序分析。测序结果显示，CTCs的拷贝数变异情况与已知的ACC相关基因突变位置相吻合，如NF1、CTNNB1、TERT、DAXX、CDKN2A、MEN1、RB1、TP53、PRKAR1A、ZNRF3和MED12等。这些基因的突变通常与ACC的发病机制和临床进展相关，因此，对这些基因的拷贝数变异进行分析，有助于更深入地了解肿瘤的分子特征。

此外，研究团队还设计了一个详细的流程图，展示了该方法的五个主要步骤：首先收集血液样本，然后通过Parsortix?系统进行大小筛选，随后进行双色免疫荧光染色，接着利用DEPArray?技术进行单细胞形态学和染色分析，最后将分离出的单细胞用于下游的分子分析，包括全基因组扩增、下一代测序（NGS）、全外显子组测序（WES）、全基因组测序（WGS）以及单细胞RNA测序（scRNAseq）。这一流程不仅提高了CTC分离的效率，还确保了后续分析的准确性，为ACC患者的个体化治疗提供了新的可能性。

研究结果表明，利用核抗原SF1作为标记物，能够更有效地识别CTCs，特别是在缺乏传统表面标记物的情况下。这种方法的优势在于其特异性较高，能够避免膜标记物可能带来的误判问题。同时，该方法在标准化和可重复性方面也表现出色，为未来的临床研究和应用奠定了基础。然而，研究人员也指出，这种方法仍面临一些挑战，例如核标记物检测可能导致回收效率降低，这需要在不同类型的肿瘤中进行进一步的优化和验证。

总的来说，这项研究为ACC患者的CTC检测和分析提供了一种新的、标准化的策略，有助于提高对这类罕见肿瘤的临床管理和治疗效果。未来的研究需要进一步验证该方法在不同ACC患者群体中的适用性，并探索其在其他癌症类型中的潜在应用。此外，还需要进行更多的临床试验，以评估该方法在实际诊疗中的价值和效果。通过不断优化和推广，这种方法有望成为一种有效的工具，用于ACC的早期诊断、病情监测和治疗评估，从而改善患者的预后和生活质量。