丁香酸通过上调SOCS3蛋白来抑制炎症

《Journal of Natural Pesticide Research》：Syringic acid suppresses inflammation by upregulation of SOCS3

植物酚酸SA通过激活CREB通路剂量依赖性上调SOCS3蛋白表达，抑制LPS诱导的炎症介质和ROS生成，为神经炎症治疗提供新机制。

　　研究揭示了植物来源的酚类化合物——肉桂酸（Syringic acid, SA）在调控小胶质细胞中的抗炎机制。SA能够选择性地提高N-9小鼠小胶质细胞中抑制细胞因子信号3（Suppressor of Cytokine Signalling 3, SOCS3）的表达水平，并且这种提升是剂量依赖性和时间依赖性的。实验还表明，在小鼠原代小胶质细胞和星形胶质细胞中也观察到了类似的效果。当小胶质细胞受到脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）刺激时，SOCS3的表达水平会下降，但在SA处理（LPS + SA）后，SOCS3的mRNA和蛋白水平显著上升。与此同时，促炎介质如肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor alpha, TNFα）、白细胞介素1受体类型I（Interleukin-1 receptor, type I, IL1R1）、白细胞介素1β（Interleukin-1 beta, IL1β）以及诱导型一氧化氮合酶（Inducible Nitric Oxide Synthase, iNOS）的表达被抑制，同时细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的生成也有所减少。此外，在LPS + SA处理的小胶质细胞中，磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（phospho-CREB）的表达增强。当使用小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）敲除cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element-binding protein, CREB）后，SA对SOCS3的上调作用被消除。这些结果确认了CREB在此过程中的关键作用。研究发现，SA通过激活CREB，进而促进SOCS3的表达，这可能为神经炎症相关疾病提供治疗潜力。

神经退行性疾病中，神经元的丢失是其显著特征，尤其是在中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）中。这些疾病的一个典型表现是多种促炎介质的过表达，伴随着神经炎症的发生。小胶质细胞作为大脑中的关键胶质细胞，能够响应炎症和退行性刺激，表达包括细胞因子、趋化因子、酶类、粘附分子等在内的多种促炎介质。由于这些介质可以引发额外的炎症反应，细胞因子在炎症过程的启动和加剧中起着重要作用。抑制细胞因子信号（Suppressor of Cytokine Signalling, SOCS）是一类具有抗炎作用的蛋白质，其作用是形成相反的反应，从而抑制细胞因子信号传导通路。SOCS家族包括SOCS1到SOCS7等多个成员，每个SOCS蛋白都具有核心的SH2结构域和位于C端的40个氨基酸组成的SOCS结构域。此外，SOCS3的N端区域还包含一个激酶抑制结构域，该结构域能够通过模拟底物结合来阻断Janus激酶（Janus kinases, JAKs）的催化活性。SOCS蛋白通过三种主要机制抑制信号传导，其中涉及SH2结构域的相互作用。例如，细胞因子诱导的SH2结合蛋白（Cytokine-inducible SH2-containing protein, CIS）和SOCS2能够通过与信号转导和转录激活因子（Signal Transducer and Activator of Transcription, STAT）竞争结合细胞因子受体胞质域上的磷酸化酪氨酸残基，从而阻止STAT的激活。相比之下，SOCS1和SOCS3则通过其SH2结构域和相邻的激酶抑制区域（Kinase Inhibitory Region, KIR）直接抑制JAK激酶的活性，进而阻断下游信号传导。

SOCS3最为人所知的是其对信号转导和转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3, STAT3）信号通路的抑制作用，同时它也是白细胞介素6（Interleukin 6, IL-6）信号级联的一部分，还可能激活环磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate, cAMP）信号通路。这一机制能够有效阻断IL-6信号的下游效应，并逆转其影响。确定哪些化学物质能够促进SOCS3的过表达，是研究减少和/或稳定细胞因子介导炎症的重要第一步。细胞因子在星形胶质细胞和小胶质细胞的炎症过程中发挥着关键作用。小胶质细胞和星形胶质细胞是大脑中的重要胶质细胞，执行多种功能，包括介导先天免疫反应。根据激活状态，小胶质细胞可以分为M1（经典激活）和M2（替代激活）两种表型。在小胶质细胞中，细胞因子激活JAK/STAT通路，诱导炎症基因的表达，而SOCS3则作为负调控因子，抑制STAT的磷酸化，从而限制过度的神经炎症。同样，星形胶质细胞根据其极化状态，可以产生促炎介质或免疫调节介质。然而，小胶质细胞和星形胶质细胞的反应表型会因神经退行性疾病的类型和阶段，以及其在大脑中的位置而有所不同。

SA作为一种酚类化合物，在葡萄、阿卡伊棕榈、枣子、南瓜、橄榄、蜂蜜、红葡萄酒等多种植物中含量较高。SA具有多种有益作用，包括保护心脏、肝脏、大脑和中枢神经系统，同时还具有抗氧化、抗炎和抗糖尿病的特性。在之前的研究中，我们发现SA能够保护血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）的完整性，减少炎症细胞因子的产生，并维持脑组织的氧化还原平衡。SA通过多种方式发挥其抗炎和抗氧化作用，包括增强内源性抗氧化防御机制和清除脑组织中的自由基。尽管SA已被证实具有神经保护作用，并且能够进入血液循环，但其穿透血脑屏障的能力仍需进一步研究。SA治疗可能有助于管理行为障碍或神经系统功能障碍，这是由于其抗炎和抗氧化特性。

在本研究中，我们证明了SA能够上调小胶质细胞中的SOCS3表达，并抑制与炎症相关的标志物的表达。此外，我们还发现SA通过激活CREB来促进SOCS3的表达。研究结果表明，SA可能通过上调SOCS3发挥其抗炎作用。这一发现为未来探索神经退行性疾病的潜在保护措施提供了新的视角。SA的抗炎机制不仅限于直接抑制促炎介质，还涉及通过激活CREB促进SOCS3的表达，从而形成一个反馈调节系统。这种机制可能在调节神经炎症反应中发挥重要作用，尤其是在慢性炎症的背景下。

在本研究中，我们采用了多种实验方法来验证SA对SOCS3表达的影响。首先，我们使用了N-9小鼠小胶质细胞作为实验模型，通过不同时间点的处理，评估SA对SOCS3表达的调控作用。使用半定量qRT-PCR和实时PCR的方法发现，SA能够显著提高SOCS3的mRNA水平，并且这种提升是时间依赖性的。SA处理后两到六小时内，SOCS3的表达达到高峰，随后在十八小时后逐渐下降。这表明SA对SOCS3的上调作用具有一定的时效性，可能在特定的时间窗口内最为有效。此外，我们还检测了SA对SOCS3蛋白水平的影响，结果表明SA能够显著提高SOCS3的蛋白表达，这进一步支持了其对SOCS3的调控作用。通过使用siRNA敲除CREB，我们发现SA对SOCS3的上调作用被消除，这表明CREB在这一过程中起到了关键的中介作用。

研究中使用的实验材料包括多种细胞培养试剂，如胰蛋白酶-EDTA（Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）、Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 Ham（DMEM/F-12 Ham 1×）、胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS）以及抗生素-抗真菌组合。这些试剂均从HiMedia公司购买，该公司位于印度马哈拉施特拉邦。此外，SA和LPS也分别从Sigma-Aldrich公司和Salmonella enterica serotype typhimurium获得。这些材料的获取为实验提供了必要的基础。

在分离小鼠原代小胶质细胞和星形胶质细胞的过程中，我们采用了Giulian和Baker的方法。通过C57BL/6 J小鼠幼崽提取混合胶质细胞，经过三次DMEM/F-12 Ham（1×）清洗后，在第九天使用摇床以37℃、240 rpm的速度摇动两小时。随后，悬浮细胞被清洗并接种到组织培养板中，继续培养一小时。通过Mac-1检测，我们发现这些细胞中几乎96%为阳性，这表明我们成功分离出了小胶质细胞。这一分离过程为后续实验提供了可靠的基础。

在SA诱导的N-9小鼠小胶质细胞中SOCS3表达上调的实验中，我们评估了SA对SOCS3表达的影响。通过不同时间点的处理，我们发现SA能够显著提高SOCS3的mRNA水平，并且这种提升具有时间依赖性。SA处理后两到六小时内，SOCS3的表达达到最高水平，随后在十八小时后逐渐下降。这表明SA对SOCS3的上调作用具有一定的时效性，可能在特定的时间窗口内最为有效。此外，我们还检测了SA对SOCS3蛋白水平的影响，结果表明SA能够显著提高SOCS3的蛋白表达，这进一步支持了其对SOCS3的调控作用。通过使用siRNA敲除CREB，我们发现SA对SOCS3的上调作用被消除，这表明CREB在这一过程中起到了关键的中介作用。

在讨论部分，我们分析了SA在神经退行性疾病中的潜在应用。慢性炎症是许多神经退行性疾病如阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）的重要临床指标。尽管小胶质细胞在免疫监视、神经保护和吞噬过程中是必不可少的，但其长期的招募和激活可能带来负面影响。长期的小胶质细胞激活已被证明与神经退行性疾病的发生和发展有关。因此，找到能够有效调控小胶质细胞激活状态的化合物，对于预防和治疗神经退行性疾病具有重要意义。SA的抗炎作用可能通过上调SOCS3来实现，这为未来研究提供了新的方向。

在研究的优势和局限性部分，我们指出尽管SA在调控SOCS3表达和减少炎症介质方面表现出良好的效果，但该研究仍存在一些局限性。例如，实验主要在小鼠模型中进行，可能无法完全反映人类情况。此外，SA对血脑屏障穿透能力的研究仍需进一步深入。未来的研究可以利用更广泛的人类模型，以确认SA在人体中的应用潜力。同时，研究可以进一步探索SA与其他抗炎机制的相互作用，以全面了解其抗炎效果。

在结论部分，我们总结了SA通过激活CREB-SOCS3通路来上调SOCS3表达，从而发挥其抗炎作用。SA的这一作用可能为神经炎症相关疾病的治疗提供新的思路。通过调控SOCS3的表达，SA可能有助于维持神经系统的稳态，减少炎症反应，进而延缓神经退行性疾病的进展。此外，SA的抗炎作用可能与其他抗炎机制协同作用，形成更全面的抗炎效果。因此，SA不仅具有作为抗炎分子的潜力，还可能在增强免疫系统对炎症的反应方面发挥重要作用。

在研究的作者贡献部分，我们列出了每位作者在研究中的具体贡献。Amina Khatun负责撰写原始稿件、验证、方法设计和实验执行；Surendra Patra和Susovon Chowdhury负责可视化和方法验证；Jayasree Saha和Ritobrata Goswami负责验证、方法设计和实验执行；Shrabani Pradhan和Kuntal Ghosh负责可视化和资源提供；Sudipta Chakrabarti负责撰写审阅稿、可视化、验证和监督。每位作者的贡献为研究的顺利完成提供了重要支持。

在伦理审批部分，我们确认本研究已获得Midnapore City College机构动物伦理委员会的批准。该审批确保了研究过程中对实验动物的伦理标准得到遵守，为研究提供了合法性和道德支持。

在资金来源部分，我们指出本研究得到了印度医学研究委员会（Indian Council of Medical Research, ICMR）的资金支持。该资金为研究提供了必要的资源，使得实验能够顺利进行。资金的获得不仅支持了实验材料的采购，还帮助研究人员在实验过程中保持高水平的科学标准。

在未引用的参考文献部分，我们列出了Shamim, 2017的研究，该研究可能与本研究的相关内容有关。尽管未直接引用，但该研究为本研究提供了背景支持，有助于理解SA在神经炎症中的作用。

在利益冲突声明部分，我们确认研究人员未披露任何利益冲突。这一声明确保了研究的客观性和公正性，为研究结果的可信度提供了保障。

在致谢部分，我们感谢Dr. Pradip Ghosh，Midnapore City College的院长，对研究的大力支持；感谢Prof. Jayasri Das Sarma，印度科学教育与研究学院，加尔各答，提供了N-9小鼠小胶质细胞系，这对研究的成功起到了重要作用；感谢Dr. Sukhamoy Gorai，Rush大学医学中心，芝加哥，伊利诺伊州，美国，对研究的正式分析和重要贡献。这些支持为研究提供了关键资源，使得实验能够顺利进行。

综上所述，本研究通过一系列实验验证了SA在调控小胶质细胞中的抗炎作用，揭示了其通过激活CREB-SOCS3通路来促进SOCS3表达的机制。SA的这一作用可能为神经炎症相关疾病的治疗提供新的思路。未来的研究可以进一步探索SA在人体中的应用潜力，以及其与其他抗炎机制的相互作用，以全面了解其抗炎效果。此外，SA对血脑屏障穿透能力的研究仍需进一步深入，这将有助于确定其在临床中的应用范围。研究结果不仅为神经退行性疾病的防治提供了新的视角，也为开发新型抗炎药物提供了理论基础。