一种使用掺硼金刚石电极进行批量注射分析的方法，用于简便地测定运动前补充剂中的吡哆醇和咖啡因的浓度

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis Open》：A simple approach for amperometric determination of pyridoxine and caffeine in pre-workout supplements using batch injection analysis with boron-doped diamond electrode

预训练补充剂中吡哆醇和咖啡因的电化学测定方法研究。采用批次注射电化学分析（BIA-AD）结合硼掺杂diamond电极（BDDE）开发了一种快速、低成本的新方法，通过电位分离和校正因子消除干扰，检测限分别为9.64和6.82 μmol/L，准确度达90%-110%，与HPLC-DAD结果一致。方法具有高灵敏度、低溶剂消耗和环境友好特性。

　　本研究提出了一种新的分析方法，用于快速、准确地测定多成分运动补充剂（MIPS）和封装的 guarana 粉末（GP）中的吡哆醇（PYR）和咖啡因（CAF）。该方法基于批注入分析（BIA）结合安培检测（AD）技术，并采用掺硼金刚石电极（BDDE）作为工作电极。这种方法不仅具有成本低、分析速度快、操作简便等优点，还具备良好的选择性和环境友好性，为运动营养品的质量控制提供了可靠的选择。

### 1. 背景介绍

运动补充剂，尤其是多成分运动补充剂（MIPS），在运动员和活跃人群中广泛使用。这些产品旨在提高注意力、减少反应时间以及增强肌肉力量。通常，这类配方包含多种生物活性成分，如支链氨基酸（BCAAs）——亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，以及肌酸、β-丙氨酸、瓜氨酸苹果酸、精氨酸、咖啡因和 B 族维生素，特别是 B6、B3、B5 和 B12。咖啡因作为主要的中枢神经系统刺激剂，其在这些产品中的存在是常见的。然而，由于产品标签往往未明确标示咖啡因和其他非营养成分的确切含量，这使得消费者难以准确了解其摄入量，进而影响其安全性和使用效果。

维生素 B6（吡哆醇）在氨基酸代谢、神经递质合成和免疫功能中起着关键作用。它作为多种酶促反应的辅因子，参与多巴胺和血清素等神经递质的合成，这些物质对于情绪调节和睡眠具有重要作用。尽管如此，市场上的产品往往未提供详细的成分含量，导致实际摄入量可能与标签信息不符。因此，对这些成分进行准确的定量分析变得尤为重要。

美国食品药品监督管理局（FDA）要求在产品标签上按重量顺序列出成分，但并未强制要求标注具体的含量。因此，成分排名靠前的物质可能含有较高的剂量，例如咖啡因，这可能超出个体的实际需求。过量摄入咖啡因已被与一系列健康风险相关联，包括易怒、头痛、焦虑和抑郁。长期摄入超过 900 毫克/天的咖啡因甚至可能引发心脏问题，如冠状动脉痉挛，即使在健康年轻人中也是如此。

另一方面，含量较少的成分可能在未达到推荐剂量的情况下无法发挥预期效果，从而降低产品的协同作用和整体功效。因此，分析技术在检测配方中的问题或掺假方面具有重要作用。目前，PYR 和 CAF 通常采用高效液相色谱法（HPLC-DAD）或液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）进行分析，但这些方法存在成本高、分析时间长和溶剂消耗大的缺点。

### 2. 材料与方法

#### 2.1. 试剂与标准品

本研究中使用了分析级或 HPLC 级的试剂，包括甲醇（99.9%）、乙腈（99.9%）、乙酸（≥99.9%）、硼酸（≥99.9%）、磷酸（≥99.9%）、氯化钾（≥99.5%）、吡哆醇（≥99%）和咖啡因（≥99%），均购自 Sigma-Aldrich?（美国密苏里州圣路易斯）。干扰研究中使用的物质包括盐酸硫胺素（维生素 B1）、核黄素（维生素 B2）、烟酸（维生素 B3）和叶酸（维生素 B9），也均购自 Sigma-Aldrich?。用于电化学分析的辅助电解质包括 Britton-Robinson 缓冲液和氯化钾溶液。所有工作溶液均使用超纯水（18.2 MΩ·cm）进行配制，该水来自 ELGA? PURELAB 纯化系统（美国伊利诺伊州伍德里奇）。

#### 2.2. 实验设备

所有电化学实验均在 PalmSens 4 恒电位仪上进行，使用 PSTrace 5.9 软件操作。实验采用传统的三电极系统，包括 Ag/AgCl（3.0 mol·L?1 KCl）参考电极、铂丝对电极和掺硼金刚石电极（BDDE）作为工作电极。BDDE 由 NeoCoat（瑞士）制造，采用热丝化学气相沉积（HFCVD）技术在掺杂的单晶硅基底上制备，其有效表面积为 0.25 cm2。在方法优化和验证过程中，同一电极被用于所有实验。

在 BIA 测量中，使用了一种商用的 3D 打印细胞，由三个主要部分组成：（i）顶部盖，设有开口以容纳参考电极、对电极和微量移液器；（ii）中间部分包含一个圆形孔，配备橡胶 O 型环（直径 0.41 cm），用于密封细胞并限制暴露的 BDDE 表面为 0.13 cm2；（iii）底部支撑，配有凹槽以放置工作电极。样品溶液的注入使用 Multipette? E3 电子微量移液器（Eppendorf），注入速率范围为 15.50 到 403.20 μL·s?1，注入体积范围为 25.00 到 300.00 μL。

在每次分析开始前，BDDE 表面会经历阳极和阴极的电化学预处理，通过施加 +192.0 mA·cm?2 的受控电流密度，持续 30 s 和 180 s，分别用于阳极和阴极处理，使用 0.5 mol·L?1 硫酸作为辅助电解质。

#### 2.3. BIA-AD 系统的优化

为了提高方法的分析性能，对 BIA 系统的电化学参数和操作条件进行了优化。优化了氧化电位脉冲，从 +0.6 V 到 +1.5 V；调整了介质的 pH 值，从 2.0 到 10.0；并测试了不同类型的辅助电解质及其浓度，包括 Britton-Robinson 缓冲液和氯化钾溶液，浓度范围为 0.05–0.5 mol·L?1。此外，通过调整注入体积（25.00–300.00 μL）和注入速率（15.50–403.20 μL·s?1），进一步优化了 BIA 条件。

#### 2.4. HPLC 分析

为了与 BIA-AD 方法进行比较，对样品进行了 HPLC 分析。采用 HPLC 系统，使用等度洗脱法，并配备 C18 柱（Phenomenex，250 × 4.5 mm，粒径 5 μm）。HPLC 系统配置了二极管阵列检测器（DAD），在 270 nm 波长下检测 PYR，在 280 nm 波长下检测 CAF。进样体积为 20 μL，柱温保持在 30°C。流动相为乙腈和酸化水（0.1% 乙酸）的混合物，比例为 ACN:H?O = 20:80（体积比）。PYR 和 CAF 的保留时间分别为 3.25 min 和 5.20 min。

#### 2.5. 分析参数

在优化条件下，对方法的线性回归、检测限（LOD）和定量限（LOQ）进行了评估。LOD 和 LOQ 值按照 IUPAC 推荐的方法计算，分别为 3·SD/m 和 10·SD/m，其中 SD 表示空白测量的十次标准差，m 表示校准曲线的斜率。校准曲线的线性通过方差分析（ANOVA）在 95% 的置信水平下验证，考虑 LOQ 值作为最低浓度点。

精密度评估通过分析同一批次内和不同批次之间的重复性进行，使用 PYR 溶液（浓度为 10.0、28.0 和 40.0 μmol·L?1）和 CAF 溶液（浓度为 7.0、21.0 和 38.0 μmol·L?1）进行，共进行了 9 次测量。计算了相对标准偏差（RSD）以评估方法的稳定性。

#### 2.6. 样品前处理

MIPS 和 GP 是复杂的基质，含有大量悬浮固体，因此在进行安培和色谱分析前需要进行样品前处理。MIPS 产品包含 60 袋，建议将一袋加入水中并每日训练前一小时服用。GP 产品为 60 胶囊瓶，建议每日服用六粒，同样在训练前一小时服用。

对于 MIPS，将一袋约 15 g 的粉末加入 500 mL 超纯水中，并手动搅拌 30 s。在分析前，使用注射器过滤器（13 mm，尼龙，0.45 μm 孔径，Whatman）过滤溶液，并进一步用 0.1 mol·L?1 盐酸（pH 4）稀释 1:100（体积比）。对于 GP，将两粒胶囊（总重量约 1.0 g）加入 10 mL 0.1 mol·L?1 盐酸（pH 4）的离心管中，混合后超声处理 10 min，然后在 3000 rpm 下离心 1 min。收集 5 mL 上清液，并将其稀释至辅助电解质（0.1 mol·L?1 KCl，pH 4）中，比例为 1:200（体积比）。

然而，由于样品中咖啡因的高浓度，为了其在 BIA-AD 系统中的测定，还需进一步稀释两次。而 PYR 不被检测，因此无需额外稀释。所有样品均从巴西伦巴底市的本地药店购买，时间为 2025 年。

### 3. 结果与讨论

#### 3.1. PYR 和 CAF 在 BDDE 表面的伏安响应

首先，通过循环伏安法（CV）研究了 PYR 和 CAF 在阴极预处理 BDDE 表面的电化学行为。在 0.1 mol·L?1 KCl 溶液（pH 6.5）中，PYR 和 CAF 的浓度均为 32.3 μmol·L?1，记录了它们的循环伏安图（CVs），如图 2 所示。观察到在 1.06 V 和 1.43 V 分别出现分离的阳极峰（ΔE ≥ 0.3 V）。此外，在 0.8 V 到 1.7 V 的范围内没有阴极峰，表明这两种物质的电化学氧化行为不可逆。

根据文献中的动力学研究，PYR 的电化学氧化涉及两个质子和两个电子的释放；而 CAF 的氧化过程则释放四个质子和四个电子。这两种物质的氧化机制被图 3 所示，分别参考了 Porto 等（2019）和 Ostoji? 等（2025）的研究。

为了评估 PYR 和 CAF 在 BIA-AD 系统中的测定可能性，首先进行了多脉冲安培法（MPA）研究。这种方法在防止电极污染和钝化方面具有重要意义，因为这些现象会降低电流响应。在本研究中，应用了三个电位脉冲：（a）清洁电位脉冲（?0.2 V，100 ms），用于更新电极表面；（b）稳定电位脉冲（0.0 V，100 ms）；以及（c）氧化电位脉冲，研究范围为 +0.8 V 到 +1.5 V，针对单独注入的 20.0 μmol·L?1 PYR 和 20.0 μmol·L?1 CAF 溶液。

通过分析每个氧化电位脉冲（图 4a）以及相应的流体力学伏安图（图 4b），发现 PYR 的氧化在 +0.9 V 开始，随着电位的增加，峰电流逐渐上升。而 CAF 的氧化则在 +1.4 V 开始，并在 +1.5 V 时表现出明显的峰电流增加，这与之前的伏安研究结果一致。为了防止可能的干扰，未进一步研究更高的电位。

因此，PYR 和 CAF 的测定分别在 +1.1 V 和 +1.5 V 进行，确保它们的氧化过程完全分离。

#### 3.2. BDDE 预处理的优化

接下来，针对 PYR 的氧化反应进行了进一步研究，因为其在运动补充剂和 guarana 粉末中的浓度低于 CAF。因此，开发一种更灵敏的方法至关重要。

首先，评估了 BDDE 的阳极和阴极电化学预处理（如第 2.2 节所述）对 PYR 氧化反应的影响。从图 5 中可以看出，阴极预处理的电极提供的电流响应比阳极预处理的电极高 42%，表明阴极预处理能显著提高 PYR 氧化反应的电子转移效率。因此，在每天分析开始时，对 BDDE 表面进行阴极极化，以更新其氢化表面。

#### 3.3. 辅助电解质的 pH、组成和浓度优化

随后，研究了辅助电解质溶液的 pH 值对 PYR 氧化反应的影响。使用 20.0 μmol·L?1 的 PYR 溶液，在 0.05 mol·L?1 的 Britton–Robinson 缓冲液中，pH 值从 2.0 到 10.0。如图 6a 所示，随着 pH 值从 2.0 增加到 4.0，PYR 的峰电流显著增加，表明高度酸性条件可能促进 H?O? 离子在电极表面的竞争反应。然而，当 pH 值从 4.0 增加到 10.0 时，峰电流逐渐减少，这可能是因为 PYR 分子（pKa = 5.2）在 pH 4.0 时带正电，有助于增强离子传输和该物质的径向扩散效率。因此，选择了 pH 4.0 的辅助电解质溶液进行后续研究。

进一步研究了辅助电解质的组成和浓度对 PYR 氧化反应的影响。在 pH 4.0 的条件下，比较了 0.1 mol·L?1 KCl 和 0.1 mol·L?1 Britton–Robinson 缓冲液。图 6b 显示，KCl 溶液提供的电流响应比 Britton–Robinson 缓冲液高 42.6%，这归因于氯离子的较小离子半径和较高的迁移率，这些因素有助于提高电极/溶液界面的电荷转移效率。因此，后续实验中使用 KCl 溶液作为辅助电解质。

还评估了 KCl 溶液浓度对 PYR 氧化反应的影响，范围为 0.05–0.5 mol·L?1。如图 6c 所示，当 KCl 浓度从 0.05 mol·L?1 增加到 0.1 mol·L?1 时，电流响应显著增加，表明离子强度的提高有助于提高电荷转移效率。然而，当 KCl 浓度超过 0.1 mol·L?1 时，峰电流显著下降，这可能是由于辅助电解质溶液粘度增加，导致 PYR 在注入过程中的传输减少。因此，后续实验中使用 0.1 mol·L?1 KCl 溶液（pH 4.0）作为辅助电解质。

#### 3.4. BIA-AD 参数的优化

随后，研究了 BIA-AD 系统中峰电流与微量移液器参数之间的关系。如图 7 所示，随着注入速率从 15.5 到 211.9 μL·s?1 的增加，峰电流逐渐上升，但在更高的注入速率下保持不变。关于注入体积，峰电流随着体积从 25 到 200 μL 的增加而显著增加。因此，选择注入速率为 211.9 μL·s?1 和注入体积为 200 μL 作为最优条件。

#### 3.5. 分析参数

在优化条件下，PYR 和 CAF 的检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为 9.64 μmol·L?1 和 6.82 μmol·L?1。通过方差分析（ANOVA）验证了校准曲线的线性关系，计算出的 F 值（Fcal）为 3685.4（PYR）和 4135.8（CAF），均高于临界 F 值（Ftab = 4.74），确认了回归模型的显著性。调整后的相关系数（R2adj）始终为 0.998，表明信号强度与分析物浓度之间存在强线性关系。此外，缺乏拟合的 F 值（1.77 对于 PYR 和 1.41 对于 CAF）低于临界值（Ftab = 3.97），表明模型的适用性良好且无显著拟合不足。

#### 3.6. 实际样品的分析

为了评估该方法在实际样品中的可行性，对商业 MIPS 和 GP 进行了前处理并使用 BIA-AD 和 HPLC-DAD 进行分析。在样品中分别加入了三种已知浓度的标准品，并测量了回收率。

在 MIPS 样品中，使用 BIA-AD 系统测定的 PYR 和 CAF 含量分别为 73.98 ± 6.02 mg/袋和 153.99 ± 1.65 mg/袋。CAF 的测定值与产品标签上的值（150 mg/袋）一致，但 PYR 的测定值低于标签上的 100 mg/袋。这表明 PYR 的含量可能未被完全标示或存在其他干扰因素。

在 GP 样品中，标签表明每份含有 75 mg CAF，但未提及 PYR 的存在。BIA-AD 分析显示每份含有 86.77 ± 6.93 mg CAF，与标签值无显著差异。PYR 在该样品中未被检测到，这可能是因为其含量极低或未被加入。

推荐的运动增强剂量为 CAF 3–6 mg/kg，超过此剂量可能增加副作用风险而不带来额外的性能提升。对于 PYR，推荐的每日摄入量为 1.4–2.1 mg，但其在高剂量下也被认为相对安全。根据测定的 MIPS 和 GP 样品中的含量，两种产品均在成人安全摄入范围内，表明每日推荐剂量的摄入不会带来健康风险。

### 4. 结论

本研究开发了一种快速、准确且选择性良好的方法，用于首次同时测定多成分运动补充剂和封装 guarana 粉末中的吡哆醇和咖啡因。在优化条件下，通过简单的校正因子，这两种分析物得以成功测定。此外，该方法在实际样品中表现出良好的适用性，提供了简易的仪器配置、相对较低的成本、潜在的便携性和较低的废弃物生成，使其成为运动补充剂质量控制的合适选择。