三元磁性壳聚糖-氧化石墨烯复合材料的简便合成方法，用于高效提取尿液中的修饰核苷类物质，以便后续进行高效液相色谱-质谱（HPLC-MS/MS）分析

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Facile synthesis of ternary magnetic chitosan-graphene oxide composites for efficient extraction of urinary modified nucleosides prior to HPLC-MS/MS analysis

准确量化尿液修饰核苷（如m3C和m?G）作为非侵入性癌症生物标志物面临浓度低和基质复杂的问题。本研究开发磁性壳聚糖-石墨烯氧化物复合材料（MCS-100GO），通过氢键和π-π作用高效吸附（3分钟达平衡，吸附容量0.7730 mg/g和0.7561 mg/g），结合HPLC-MS/MS方法，灵敏度达0.015-0.030 μg/L，线性范围宽（R2>0.9995），且无显著基质效应，为临床诊断提供高效策略。

　　

乔登|李建良|徐静静|赵晓静|魏丹|王旭

中国浙江省杭州市杭州医学院药学院，邮编310058

摘要

尿液中修饰核苷的准确定量分析是癌症非侵入性生物标志物的研究关键，但受其微量浓度和复杂基质干扰的阻碍。为克服这一挑战，我们通过将壳聚糖（CS）和氧化石墨烯（GO）结合到磁性核心上，制备出一种新型三元磁性复合材料（MCS-100GO），并将其用于磁性固相萃取（MSPE）作为吸附剂。该吸附剂利用了CS和GO的氢键作用以及GO的π-π相互作用，实现了高效捕获；同时磁性核心确保了快速简便的分离。系统优化表明，该复合材料对3-甲基胞苷（m³C）和7-甲基鸟苷（m⁷G）具有优异的性能。MCS-100GO复合材料在3分钟内达到吸附平衡，最大吸附容量分别为0.7730 mg/g（m³C）和0.7561 mg/g（m⁷G）。根据FDA指南验证的MCS-100GO基MSPE-HPLC-MS/MS方法表现出极高的灵敏度（LOD：0.015–0.030 μg/L）、宽线性范围（0.050–50 μg/L；R² > 0.9995）和高精度（RSD < 6.4%）。平行实验显示变异系数（CV）为9.7%，证实不存在显著的基质效应。与现有方法相比，该方法在吸附剂用量、灵敏度和速度方面具有显著优势，为尿液核苷生物标志物的高通量分析提供了一种高效策略。

引言

早期预防和早期检测是现代肿瘤学的核心策略，推动了可靠且非侵入性癌症生物标志物的研究[1]、[2]、[3]。其中，尿液修饰核苷因其作为RNA代谢副产物的特性，在癌变过程中其表达水平会发生变化，并通过尿液排出，成为评估细胞病理状态的理想指标[4]。特别是7-甲基鸟苷（m⁷G）和3-甲基胞苷（m³C）等甲基化核苷，在多种癌症和其他疾病中的诊断潜力备受关注[5]、[6]。尿液因其非侵入性采集和易获取性，成为具有诊断价值的生物样本。例如，Yao等人[7]发现糖尿病视网膜病变患者（n = 23）的尿液中2′-O-甲基胞苷（Cm）水平显著高于健康对照组（n = 21；P < 0.01），表明其具有诊断潜力。在乳腺癌研究中，Omran等人[8]使用GC-MS检测了56名乳腺癌患者、22名良性乳腺疾病患者和20名健康女性的尿液样本，发现1-甲基腺苷（m¹A）、1-甲基鸟苷（m¹G）和8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG）在癌症组中的水平显著升高（P < 0.001），即使在疾病早期阶段也是如此，这表明它们具有早期筛查的潜力。

然而，将这一潜力转化为临床工具面临重大分析挑战，因为修饰核苷在复杂的尿液基质中仅以微量存在。高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）凭借其高灵敏度、准确性和选择性，已成为生物标志物发现的强大工具[9]、[10]、[11]、[12]。目前，HPLC-MS/MS广泛用于尿液样本中修饰核苷的检测[13]、[14]、[15]，但直接分析常受严重基质效应影响，导致低丰度修饰核苷的定量不准确。因此，开发一种能够富集目标修饰核苷并去除基质干扰的有效预处理方法至关重要。

磁性固相萃取（MSPE）因其操作简便和快速分离特性而成为良好解决方案[16]、[17]。然而，传统MSPE材料往往缺乏对修饰核苷的特异性亲和力和抗干扰能力。例如，氧化石墨烯（GO）具有高比表面积和丰富的含氧官能团（如羟基、环氧基、羧基）[18]，而壳聚糖（CS）则提供丰富的氢键吸附位点（氨基和羟基）[18]。但单独使用这些材料存在缺点：GO因亲水性及π-π相互作用导致的层间堆叠而难以回收，而CS在酸性环境中稳定性较差[19]。为此，本研究提出了制备新型三元磁性壳聚糖-氧化石墨烯复合材料（MCS-100GO）的方法。这种策略具有以下优势：（1）将CS和GO的吸附功能集成到单一复合材料中；（2）利用GO作为机械强度高的基质，有效提升CS的机械和化学稳定性；（3）实现磁性分离，简化实验流程。核心假设是这种多相互作用机制能在复杂干扰存在下提供优异的选择性和性能。

本研究设计了一种三元磁性壳聚糖-氧化石墨烯复合材料（MCS-xGO，其中x表示GO的质量），以解决尿液样本中微量修饰核苷的分析难题，结合了MSPE和HPLC-MS/MS技术。以m³C和m⁷G为模型化合物（图1），该方法表现出超快吸附平衡（3分钟）、高吸附容量，并通过平行实验验证无显著基质效应。本研究为尿液样本中微量修饰核苷的高效富集和分析提供了新策略，同时展示了多组分复合材料在临床诊断中的应用潜力。

材料与方法

本研究获得了杭州医学院伦理委员会的批准（批准编号：LL2023–06），并遵循赫尔辛基宣言进行。所有参与者均签署了知情同意书。

吸附剂性能比较评估

吸附性能测试（图2a）显示，在五种用于捕获修饰核苷的材料中，MGO由于其最大的比表面积和丰富的活性位点而具有最高的吸附效率；MCS-xGO系列随着GO负载量的增加吸附效率逐渐提高，其中MCS-100GO的性能接近MGO。回收测试（图2b）证实m³C和m⁷G的回收效果良好

结论

本研究通过多组分组装策略成功制备了一种新型三元磁性壳聚糖-氧化石墨烯复合材料（MCS-100GO）。该复合材料结合了壳聚糖的氢键吸附位点、氧化石墨烯的高比表面积和π-π堆叠能力以及磁性核心的快速分离特性，使其具有快速吸附平衡和高吸附能力

作者贡献声明

乔登：撰写初稿、方法学设计、资金申请、数据分析、概念构思。李建良：方法学设计、实验实施。王旭：撰写与编辑、监督。魏丹：方法学设计、数据分析。徐静静：资源准备、方法学协助。赵晓静：实验实施。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了浙江省自然科学基金（项目编号：LTGC23B050009、LTGY23B050004、LTGC24B050012）的资助。