利用消化辅助的毛细管电泳十二烷基硫酸钠（CE-SDS）技术监测单克隆抗体中的半乳糖基化现象

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Leveraging Digestion-Assisted Capillary Electrophoresis Sodium Dodecyl Sulfate (CE-SDS) to Monitor Galactosylation in Monoclonal Antibodies

单克隆抗体糖基化分析中，通过IdeS酶解预处理发现高分辨率毛细管电泳-SDS（CE-SDS）可检测到重链分裂现象，证实由N-连接半乳糖基化导致。比较CE-SDS与微芯片电泳-SDS（MCE-SDS）方法，前者分辨率更高，能区分半乳糖基化（G0/G1/G2）的三种FC'2片段。该技术还可用于FC融合蛋白的糖基化分析，支持抗体变体与生物类似药的质量评估。

　　在生物制药领域，单克隆抗体（mAbs）已经成为药物开发的重要组成部分，占据所有生物制剂的大约70%。这些抗体因其在心血管、自身免疫、炎症、肿瘤和传染病等治疗领域的广泛应用而备受关注。然而，mAbs的复杂结构也带来了挑战，尤其是在其生产过程中可能出现的变体和翻译后修饰（PTMs）对产品质量和疗效的影响。因此，开发和优化用于监测mAbs结构和修饰的分析方法成为制药行业的重要任务。本研究探讨了一种新的分析策略，即通过结合酶解和电泳技术，利用CE-SDS（毛细管凝胶电泳-十二烷基硫酸钠）方法对单克隆抗体和Fc融合蛋白的糖基化情况进行更深入的分析。

### 一、背景与研究意义

单克隆抗体是一种由两个重链和两个轻链组成的异四聚体，其结构复杂性使得在生产过程中容易产生多种变体。这些变体可能包括翻译后修饰，如氧化、脱酰胺、氨基酸异构化和糖基化等。糖基化，特别是N-糖基化，被认为是单克隆抗体的关键质量属性（CQA），因为它不仅影响药物的效力和稳定性，还可能影响其在体内的药代动力学和免疫原性。因此，准确评估单克隆抗体的糖基化状态对于确保其质量和一致性至关重要。

在实际生产过程中，单克隆抗体可能会因细胞表达条件、细胞系特性或制造过程中的物理和化学压力而产生不同的糖基化形式。这些糖基化形式可能包括不同数量的唾液酸、甘露糖、岩藻糖和半乳糖等。特别是半乳糖的修饰程度，对于抗体的药代动力学和免疫原性具有重要影响。然而，传统的糖基化分析方法，如释放糖基分析（released glycan analysis）通常需要复杂的质谱技术，这在实际操作中可能较为繁琐和耗时。

### 二、研究方法与技术细节

本研究采用了多种技术手段，以更全面地分析单克隆抗体和Fc融合蛋白的糖基化特征。首先，使用了CE-SDS（毛细管凝胶电泳-十二烷基硫酸钠）方法，在还原条件下对多个单克隆抗体样本进行分析。在常规分析中，研究人员观察到一种独特的重链峰分裂现象，这一现象在不同的mAb样本中出现，但在MCE-SDS（微芯片毛细管电泳-十二烷基硫酸钠）方法中未被观察到。这一差异可能与两种方法在分辨率和检测灵敏度上的不同有关。

为了进一步确认这种分裂现象的来源，研究团队使用了不同的酶解方法，包括PNGase F（用于完全去除N-糖基化）和β-半乳糖苷酶（用于去除半乳糖）。这些酶解处理后的样本在CE-SDS分析中显示出更清晰的峰形，从而支持了半乳糖修饰与重链峰分裂之间的关联。此外，研究还采用了GalactEXO?柱和TransGLYCIT?试剂盒，对特定的G1和G2糖基化形式进行改造，以验证其对CE-SDS峰识别的影响。

在实验过程中，研究团队还使用了不同的电泳条件，如改变样品的稀释浓度、缓冲液成分、pH值以及施加的电压等，以优化分析效果。通过这些实验，研究人员发现，CE-SDS方法在高分辨率下能够更清晰地识别出不同糖基化形式的峰，而MCE-SDS方法由于其高通量特性，可能在分辨率上有所不足，尤其是在检测某些低丰度糖基化形式时。

### 三、研究结果与分析

通过上述方法，研究团队确认了重链峰分裂现象主要与半乳糖修饰有关。具体而言，当样本经过β-半乳糖苷酶处理后，分裂的重链峰消失，仅留下一个单一的峰，表明这些分裂峰是由于半乳糖的存在而导致的。进一步的实验表明，这种分裂现象在不同糖基化形式中表现不同，尤其是在半乳糖修饰程度较高的情况下更为明显。

此外，研究还发现，某些特定的糖基化形式（如G1和G2）在CE-SDS分析中表现出不同的迁移时间和峰面积，这表明它们在结构上存在差异。通过与MCE-Oligo（微芯片糖基分析）方法的对比，研究团队发现，虽然MCE-SDS方法在高通量分析方面具有优势，但在检测半乳糖修饰的具体形式时，其分辨率和准确性不及CE-SDS方法。因此，CE-SDS方法更适合用于深入分析和定量评估半乳糖修饰的情况。

研究还涉及了对Fc融合蛋白的分析。通过使用IdeS酶对这些蛋白进行处理，研究人员能够分离出Fc片段，并对其进行糖基化分析。结果表明，这些融合蛋白的Fc部分同样存在半乳糖修饰，并且其修饰程度与mAbs类似，进一步验证了CE-SDS方法在分析Fc融合蛋白中的适用性。

### 四、研究结论与应用前景

本研究的主要结论是，通过结合酶解和CE-SDS分析，可以有效地识别和量化单克隆抗体和Fc融合蛋白中的半乳糖修饰。这种方法不仅能够检测出半乳糖修饰的存在，还能区分不同的糖基化形式，从而为药物开发提供更全面的信息。研究还指出，尽管MCE-SDS方法在高通量分析中具有优势，但在检测某些特定的糖基化形式时，其分辨率和准确性仍存在不足。

因此，CE-SDS方法，特别是结合了酶解处理的CE-SDS，为生物制药行业提供了一种新的、高效的分析工具。这种方法可以用于监测和评估药物相关变体（如大小和电荷变体）的特征，并支持药物稳定性评估。此外，研究还强调了这种方法在生物仿制药开发中的重要性，因为糖基化水平可能因细胞系和表达条件的不同而有所差异，这可能影响药物的疗效和安全性。

总的来说，本研究通过创新的分析策略，为单克隆抗体和Fc融合蛋白的糖基化分析提供了新的思路和方法。这种方法不仅能够提高分析的准确性和分辨率，还能减少对复杂质谱技术的依赖，从而在实际应用中更具优势。未来，随着生物制药技术的不断发展，这种结合酶解和电泳的分析方法有望在药物开发和质量控制中发挥更大的作用。