《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Key considerations for phosphatidylserine quantification by 31P-NMR in pharmaceutical analysis
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定量31P NMR结合三苯磷酸内标法研究磷脂酰丝氨酸质量控制方法，关键因素包括样本制备（EDTA-Cs溶液改善谱线分辨率）、分子量校准（764.03 g/mol）及后处理峰拟合技术以减少操作者偏差。
Daniela Rebollar-Ramos|Shao-Nong Chen|David C. Lankin|Robert A. Kleps|Guido F. Pauli
美国伊利诺伊大学芝加哥分校Retzky药学院药用植物学研究所与药学系，IL 60612
摘要
磷脂酰丝氨酸（PS）是一种对细胞膜组成至关重要的磷脂，在大脑中的浓度很高。由于其神经保护作用以及对中枢神经系统（CNS）疾病患者的益处，PS被广泛用作膳食补充剂。本研究旨在开发一种定量核磁共振（qNMR）方法，该方法使用三苯基磷酸盐（TPP）作为内标（IC）对PS样品进行分析。研究结果表明，在方法开发过程中有几个关键方面：i) 样品制备是成功进行qNMR分析的关键步骤；添加0.2 M EDTA（pH 7.2-7.5，用Cs?CO?调节）可以改善谱线的形状，从而提高整体分辨率；ii) 分析物的分子量对分析结果有显著影响；iii) 数据采集后的处理条件，包括窗函数和积分标准，虽然影响较小但仍然存在，因此应被视为任何PS定量常规方法不可或缺的一部分。为了解决后者问题，发现峰值拟合是一种有效的方法，可以减少操作者的偏差，尤其是在积分过程中，由于每种化学物质的31P-NMR峰模式接近单峰，这种方法是可行的。
引言
磷脂是由亲水头部和疏水尾部组成的甘油脂类化合物，这解释了它们作为动物和植物细胞膜结构成分的两亲性质和重要性。磷脂的结构由四个基本单元组成：甘油或鞘氨醇作为骨架、脂肪酸、带负电的磷酸基团以及含氮的糖或其他化合物（图1）[1]，[2]。
以甘油为骨架的磷脂称为甘油磷脂，在甘油的sn-1和sn-2位置各含有一个脂肪酸，而sn-3位置则连接着磷酸基团，该基团可能附着有胆碱、乙醇胺、丝氨酸或肌醇。这个极性基团的种类决定了磷脂的类型，分别是磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）或磷脂酰肌醇（PI）。常见的甘油磷脂中的脂肪酸包括棕榈酸（C16）、硬脂酸（C18）、油酸（C18:1, ω-9）和亚油酸（C18:2, ω-6）[2]。
磷脂酰丝氨酸（PS）在真核细胞膜的磷脂双层中占比相对较低，仅占总磷脂的2-10%。然而，脑细胞中的PS磷脂含量较高[3]。PS在信号传导途径、酶激活、细胞凋亡、神经元存活、神经传递和突触形成中起着关键作用[4]。由于其具有抗炎作用，可以预防神经炎症，因此外源性给予PS可能对患有中枢神经系统（CNS）疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病或重度抑郁症）的患者有益[4]。
PS的健康益处使其被广泛用作膳食补充剂。然而，目前尚无通用方法来指导这种常用膳食补充剂的质量控制。此外，由于主流分析方法的适用性和/或特异性不足，PS的分析存在挑战。一些研究尝试使用液相色谱结合蒸发光散射检测（ELSD）[5]或质谱（LC-MS）[6]来进行分析。
三十多年来，31P NMR光谱技术一直被用作分析不同来源磷脂的可靠工具[7]，[8]，[9]，[10]。选择31P NMR而非其他核的原因是磷脂中存在磷酸基团，且31P同位素的天然丰度为100%。此外，1H和13C NMR光谱无法有效分析磷脂混合物，因为酰基链种类繁多，导致1H峰型重叠或13C NMR灵敏度降低[11]。
在31P NMR光谱中，脂肪酸侧链对磷酸基团的化学位屏蔽或去屏蔽作用较弱[12]。单独的磷酸基团（附着有胆碱、丝氨酸、肌醇等）受其电子环境的影响，产生单一的NMR峰[11]。光谱的单峰特性、样品处理的便利性以及分析时间短是选择31P NMR作为PS定量理想方法的重要考虑因素。
本研究旨在开发一种qNMR方法，为PS的药品质量控制检测提供参考。该方法借鉴了磷虾油专论[13]中的方法，使用三苯基磷酸盐（TPP）作为内标（IC）进行定量31P-NMR（qPNMR）分析。
材料
研究了两种市售的磷脂酰丝氨酸（PS）产品，其标签上标注的PS含量分别为50%和70%。由于保密协议，未公开供应商信息，分别称为供应商1（V1）和供应商2（V2）。
内标和化学位移参考物质三苯基磷酸盐（TPP）购自Sigma-Aldrich（Merck KGaA，德国达姆施塔特）。使用的氘代溶剂为CD?OD和CDCl?。
样品制备
为了确定最佳的磷脂酰丝氨酸（PS）分析方案，评估了多种样品制备方法。样品制备方法借鉴了Bligh和Dyer的脂质提取方法[16]，并修改为使用EDTA-Cs溶液作为水相进行提取[12]。EDTA-Cs溶液之前已被用于从多种来源（包括不同动物组织、食用油、卵磷脂和豆类）中提取磷脂[12]，[14]，[17]。
结论
在开发用于磷脂酰丝氨酸定量分析的药品质量控制方法时，确定了一些关键因素。样品制备对于PS的qNMR分析至关重要：使用EDTA-Cs溶液可以改善谱线形状，从而提高分析质量。用于PS分析的分子量也很重要；作为药品质量控制方法的一部分，建议使用764.03 g/mol作为分子量。
作者贡献声明
Robert A. Kleps：撰写、审稿与编辑、数据分析。Guido F. Pauli：撰写、审稿与编辑、资源管理、项目协调、资金筹集、概念构思。Shao-Nong Chen：撰写、审稿与编辑、监督。David C. Lankin：撰写、审稿与编辑、监督、数据分析。Daniela Rebollar-Ramos：撰写初稿、验证、方法设计、实验实施、数据分析。
致谢
本研究部分得到了美国药典（Rockville, MD）的资助（项目编号G1225）。作者感谢JEOL USA公司的Ashok Krishnaswami博士在NMR技术方面的专业知识和操作支持，并感谢该公司提供的硬件支持。
