对不明原因反复流产的女性NK细胞受体库进行特征分析

《Journal of Reproductive Immunology》：Profiling NK cell receptor repertoire of women with idiopathic recurrent pregnancy loss

子宫NK细胞受体谱差异与复发性流产相关

　　自然杀伤细胞（Natural Killer cells，NK细胞）在理解复发性妊娠丢失（Idiopathic Recurrent Pregnancy Loss，iRPL）的发病机制方面得到了广泛研究。然而，尽管已有大量研究，但NK细胞频率与iRPL之间的明确关联尚未完全建立。传统研究主要关注外周血NK细胞（Peripheral NK cells，pNK细胞），但这些细胞可能无法准确反映子宫内的免疫环境。因此，本研究旨在探讨从月经血中分离出的子宫NK细胞（Uterine NK cells，uNK细胞）的受体谱，并将其与具有正常妊娠的对照组进行比较。研究结果揭示了iRPL患者中多个uNK细胞群的2B4和NKp44受体表达强度显著降低。此外，根据巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）感染状态进行分层分析发现，CMV阳性女性的uNK细胞中NKp44表达水平显著高于CMV阴性女性，同时NKG2A+KIRs+LILRB1+NKG2C-的uNK细胞频率也更高（10.3% vs. 4.2%，p=0.025）。令人惊讶的是，这一群体在初次iRPL患者中的比例最低，相较于继发性iRPL和对照组女性（2.6% vs. 8.6%，12.8%，p=0.005）。

复发性妊娠丢失（Recurrent Pregnancy Loss，RPL）是一种影响超过2-5%尝试怀孕夫妇的早期妊娠并发症（El Hachem等，2017）。RPL被定义为在妊娠24周之前连续失去超过两次妊娠（Atik等，2018）。尽管已识别出多种可能导致RPL的因素，但仍有超过50%的病例病因不明（El Hachem等，2017，Kutteh，2015）。人们假设，在母胎界面的关键过程中，如蜕膜化、着床和胎盘形成期间，母体免疫反应不足可能是导致iRPL发生的原因之一（Ticconi等，2019）。NK细胞在母胎界面中最为丰富，主要参与调节滋养层细胞侵袭和螺旋动脉血管重塑（King等，1991，King等，1989）。子宫NK细胞（uNK细胞）的表型和功能与外周血NK细胞（pNK细胞）存在显著差异（Manaster等，2008，Feyaerts等，2018，King等，1993）。NK细胞通常根据CD16和CD56的表达水平分为两个主要群体（Smith等，2020）：具有细胞毒性的、主要存在于循环系统中的CD56dimCD16+ NK细胞，以及具有免疫调节功能的CD56brightCD16+/- NK细胞，后者在子宫等组织中占主导地位（Bj?rkstr?m等，2016）。近年来，对NK细胞受体（NKR）谱系的研究发现，外周血和其他组织中的NK细胞远比传统的双群体模型更加多样化（Smith等，2020，Bj?rkstr?m等，2016，Horowitz等，2013）。NK细胞的功能受到激活和抑制性受体表达的调控，这些受体包括自然细胞毒性受体（NCRs：NKp30、NKp44、NKp46）、C型凝集素异二聚体家族（NKG2：NKG2A、NKG2C、NKG2D）、Killer免疫球蛋白受体（KIRs）、免疫球蛋白样转录本（LILRB1）以及共受体如2B4（CD244）和CD161（Male和Moffett，2023）。NKG2D、NKp30、NKp46和CD244在蜕膜NK细胞上的刺激会增加蛋白质合成，从而促进血管生长和滋养层细胞侵袭（Hanna等，2006；Vacca等，2008；El Costa等，2009）。KIRs、LILRB1和NKG2A分别与滋养层细胞上的HLA-C、HLA-G和HLA-E配体相互作用，支持母胎耐受（Zhou等，2025；King等，2000）。

pNK和uNK细胞的丰度和功能异常已被与iRPL相关联（Kwak-Kim和Gilman-Sachs，2008，Quenby等，1999，Sfakianoudis等，2021）。一项荟萃分析显示，RPL患者的pNK细胞数量高于对照组，但研究间存在显著的异质性（Seshadri和Sunkara，2014）。此外，pNK细胞数量并不能预测RPL女性后续妊娠的流产风险（Tang等，2011）。2023年的一项荟萃分析发现，RPL患者与对照组之间uNK细胞的丰度没有显著差异，且uNK细胞水平与后续妊娠结果也没有显著关联（Von Woon等，2022）。虽然这些研究使用的是蜕膜组织或通过活检获取的子宫内膜组织，但月经血（Menstrual Blood，MB）作为一种非侵入性且已被广泛接受的生物样本，能够有效评估uNK细胞（van der Molen等，2014，Feyaerts等，2018，Ivarsson等，2017）。然而，针对iRPL女性月经血中uNK细胞水平的研究结果却存在矛盾，有的研究显示uNK细胞总数无差异（Hosseini等，2014，Benner等，2022），有的研究则发现uNK细胞数量减少（Tong等，2021，Marron和Harrity，2022），还有的研究显示uNK细胞数量增加（Vomstein等，2023）。尽管我们发现iRPL与对照组之间uNK细胞总数没有显著差异，但通过进一步分群分析发现，iRPL女性的CD56dimCD16+ uNK细胞比例增加，而CD56brightCD16+/- uNK细胞比例减少（Benner等，2022）。具体而言，CD56brightCD16+/- uNK细胞的比例是区分iRPL病例与对照组的重要特征之一。此外，iRPL患者中观察到子宫NK细胞上的NKp46表达减少以及KIR2DS2基因表达降低（Mansour等，2020；Fukui等，2017）。因此，扩大对uNK细胞多样性的研究，超越对总细胞数量或比例的分析，可能有助于识别uNK细胞与iRPL之间的关联。

基于上述研究背景，我们采用无监督分析方法，评估了具有iRPL病史的女性的uNK细胞受体谱，并将其与成功妊娠的女性进行比较。本研究中使用的样本来源于具有规律月经周期的iRPL患者和对照组女性。外周血样本的采集时间在月经开始前几天或月经期间。我们仅纳入至少经历过三次连续的iRPL女性，以降低可能因染色体异常导致的流产的纳入风险。如果已知存在流产原因，如抗甲状腺抗体阳性等，则排除这些参与者。

研究结果显示，iRPL患者与对照组女性在全身和子宫免疫细胞组成方面没有显著差异。此前的研究表明，免疫细胞的比例在PB和MB之间存在差异，并且不同的免疫细胞群体可以区分iRPL与正常妊娠（Benner等，2022，van der Molen等，2014）。通过viSNE降维可视化技术，可以清晰地看到系统性免疫细胞与子宫免疫细胞之间的差异（图1 A-B）。基于FlowSOM聚类方法，我们识别出十三个元簇（图1C-D），其中八个簇在PB和MB之间存在显著差异（图1C和E）。两个子集显示出不同的特征，可能代表不同的功能状态。

本研究的讨论部分指出，通过比较iRPL患者和成功妊娠女性的uNK细胞受体谱，我们发现iRPL患者中存在多个uNK细胞群的2B4和NKp44受体表达强度显著降低。2B4作为NCRs（如NKp44）的共刺激受体，能够增强NK细胞的激活并促进包括IL-8和VEGF在内的细胞因子产生，这些细胞因子对于滋养层细胞侵袭至关重要。因此，2B4和NKp44表达的减少可能会影响NK细胞的激活状态，进而影响胎盘形成和妊娠维持的能力。此外，我们还观察到CMV感染状态对uNK细胞受体表达的影响。CMV阳性女性的uNK细胞中NKp44表达水平显著高于CMV阴性女性，同时NKG2A+KIRs+LILRB1+NKG2C-的uNK细胞频率也更高。这一发现提示，CMV感染可能在调节uNK细胞功能方面发挥作用，可能通过影响受体表达模式，进而影响母胎免疫平衡。然而，这一特定的uNK细胞群体在初次iRPL患者中的比例最低，相较于继发性iRPL和对照组女性显著降低，这可能表明不同的iRPL类型在uNK细胞受体谱上存在差异。这些结果进一步强调了uNK细胞在iRPL中的重要性，并表明其功能可能受到多种因素的影响，包括妊娠史和感染状态。

在本研究中，我们还探讨了uNK细胞受体谱的多样性及其与iRPL之间的潜在关联。尽管传统研究主要关注总细胞数量或比例的变化，但uNK细胞的受体表达模式可能更准确地反映其功能状态。例如，2B4和NKp44的表达强度变化可能比单纯的数量变化更能揭示uNK细胞在iRPL中的作用。此外，NKG2A+KIRs+LILRB1+NKG2C-的uNK细胞比例的变化也可能与iRPL的病理机制相关。这一群体的表达模式可能反映了NK细胞在调节母胎免疫耐受方面的功能状态，其减少可能意味着免疫调节能力的下降，从而导致妊娠失败。因此，未来的研究需要进一步探讨这些受体表达模式的变化是否与特定的免疫机制相关，以及这些变化是否可以作为iRPL的生物标志物。

本研究的结果表明，uNK细胞的受体谱可能比总细胞数量或比例更能揭示iRPL的免疫机制。此外，研究还强调了CMV感染对uNK细胞功能的影响，以及不同类型的iRPL（如初次和继发性）在uNK细胞受体表达上的差异。这些发现可能对iRPL的诊断和治疗提供新的思路，例如，针对特定受体表达模式的干预措施可能有助于改善妊娠结局。然而，本研究的样本量相对较小，未来需要更大规模的临床研究来验证这些发现，并进一步探索uNK细胞受体谱的变化是否具有预测价值。

最后，本研究的作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响研究结果。同时，作者感谢所有参与研究的女性以及Bram van Cranenbroek在数据处理方面的帮助。研究的原始数据将在无任何限制的情况下由作者提供。