《Journal of Virological Methods》：Development of a dual-label time-resolved fluorescence immunoassay platform for simultaneous detection of canine distemper virus and parvovirus
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建立双标记时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）平台用于同步检测犬瘟热病毒（CDV）和犬细小病毒2型（CPV-2），检测限分别为0.43 ng/mL和0.73 ng/mL，临床验证灵敏度90.24%-88.37%，特异性97.37%-98.65%，与PCR高度一致，为犬类病毒性疾病的快速诊断提供新工具。
李来青|赖宏瑞|梁焕坤|郭桂玲|陈翠翠|贾强
广州城市职业学院食品与健康学院，中国广州，510405
摘要
目的
犬瘟热病毒（CDV）和犬细小病毒2型（CPV-2）是两种具有高度传染性和严重致病性的病毒，常见于犬只中，尤其是对幼犬具有致命性。本研究旨在建立一种双标记时间分辨荧光免疫测定法（TRFIA），以检测和区分CDV和CPV-2感染。
方法
采用铕（Eu3?）/钐（Sm3?）螯合物双标记法建立了夹心TRFIA方法，并对其进行了优化。随后，将该方法制成试剂盒，并构建了TRFIA平台，评估了其实验室性能（检测限、特异性、准确性和稳定性）以及在犬临床样本中检测目标病毒的能力。
结果
构建了一种用于同时检测CDV和CPV-2的双标记TRFIA平台，并对其进行了严格验证。该TRFIA平台的检测限分别为CDV 0.43 ng/mL和CPV-2 0.73 ng/mL，对两种目标具有高特异性。临床临界值分别为CDV 5.47 ng/mL和CPV-2 6.96 ng/mL。测内变异系数范围为1.11%至5.53%，加标回收率在104.74%至108.50%之间。与PCR方法的符合度非常好（Pearson’s χ2检验，P < 0.001）。临床验证显示，CDV的诊断灵敏度/特异性分别为90.24%/97.37%，CPV-2的诊断灵敏度/特异性分别为88.37%/98.65%。
结论
这种用于同时检测CDV和CPV-2的TRFIA平台表现出稳健的检测限、特异性、准确性，以及可靠的临床灵敏度和特异性。它为区分CDV和CPV-2感染提供了额外的工具，可能有助于改进未来的疾病预防策略。
引言
犬瘟热和犬细小病毒是两种高度传染性的疾病，对犬只的健康构成威胁，具有广泛的流行范围和深远的影响。在全球范围内，这两种传染病在温带地区的春季、夏季和秋季出现季节性高峰，这可能归因于犬只户外活动的增加（Rivera-Martínez等，2024；Pu等，2024；Horecka等，2020）。宠物交易市场、流浪犬聚集地以及免疫接种不规范或未记录的繁殖场是病毒爆发的高风险热点。近年来，随着宠物饲养数量的增加和跨区域流动的频繁，某些地区（如土耳其）的发病率可超过30%，受感染幼犬的死亡率甚至超过80%（Temizkan和Sevinc Temizkan，2023）。目前，疫苗接种是最有效的预防措施，但流浪犬的疫苗接种覆盖率不足以及繁殖设施中不标准或未记录的免疫接种做法仍然对这些疾病的预防和控制构成重大挑战（Decaro等，2020）。
犬瘟热病毒（CDV）是导致犬瘟热的唯一病原体，具有高度传染性，死亡率超过80%（Martella等，2008）。CDV感染的自然宿主主要是犬科（Canidae）和鼬科（Mustelidae）动物，主要通过气溶胶和呼吸道飞沫传播。近年来，有报道指出食肉目（Carnivora）、偶蹄目（Artiodactyla）的猪科（Suidae）、灵长目（Primates）的猕猴（Macaca）和鳍足目（Pinnipedia）的海豹科（Phocidae）动物也出现了CDV自然感染病例（Espinoza等，2023）。犬细小病毒2型（CPV-2）是犬细小病毒病的主要致病因子，主要感染幼犬，其特征是严重呕吐、出血性肠炎和白细胞显著减少（Goddard和Leisewitz，2010）。犬（和大熊猫）等宿主经常同时感染这两种病毒，因此需要快速检测以实现早期诊断、早期隔离和早期针对性治疗（Liu等，2025年1月23日；Antiya等，2025年）。
目前市场上用于检测CDV和CPV-2的免疫学试剂盒包括基于侧向流动免疫测定法、酶联免疫吸附测定法（ELISA）和时间分辨荧光免疫测定法（TRFIA）的试剂盒（Cao等，2024a；Tuteja等，2022）。然而，这些试剂盒通常只能检测其中一种病毒，要么是CDV，要么是CPV-2，无法实现同时检测和区分。在印度古吉拉特邦的一项最新调查中，PCR阳性的犬粪便样本中有27.56%（35/127）同时感染了CPV-2和CDV，使得CPV-2 + CDV成为最常见的共感染组合（Antiya等，2025）。因此，有必要建立一种能够同时检测CDV和CPV-2的新方法。在本研究中，我们的团队尝试使用双标记TRFIA建立了一种同时检测CDV和CPV-2的新方法，并将其开发成试剂盒并构建了TRFIA平台。通过对该平台检测限（LOD）、特异性、准确性、稳定性和整体性能的全面评估，证明了其在临床应用中的有效性。
部分内容摘要
抗原、抗体、缓冲液和样本
CDV抗原（核蛋白，N蛋白，在大肠杆菌中表达）和CPV-2抗原（病毒蛋白2（VP2）蛋白，在大肠杆菌中表达）及其对应的抗体（CD1 vs CD2，CP1 vs CP2）由我们的团队制备。Eu3?和Sm3?标记试剂购自PerkinElmer（美国诺沃克）。研究中使用的试剂和缓冲液均在实验室制备。从疑似CDV感染的犬只中获得了42份粪便样本，从疑似...
测试程序
经过多次优化后，最终确定了以下方案：（1）在标记过程中，分别向500 μL的Eu3?和Sm3?螯合物溶液中加入1.5 mg的CD2抗体和2 mg的CP2抗体；（2）在检测中使用90 μL的Eu3?–CD2结合物和110 μL的Sm3?–CP2结合物；（3）反应时间为50分钟。
检测在预编程的时间分辨荧光计上进行。具体操作为：每孔加入50 μL样本和90 μL的Eu3?–CD2结合物。
讨论
TRFIA是一种超灵敏的非放射性标记技术，使用镧系元素（如铕、钐、铽、镝）或其螯合物作为标记物，可以减少非特异性信号和背景干扰，从而能够检测抗原、抗体、激素、肽、蛋白质、核酸、生物细胞等（Yuan和Wang，2005a）。与传统方法相比，TRFIA具有无放射性、低背景噪声、检测速度快等优点。
利益冲突
所有作者及其所在机构均无需要声明的财务或非财务利益冲突。
CRediT作者贡献声明
李来青：方法学设计、概念构思。赖宏瑞：方法学实施。梁焕坤：资源协调、项目管理。郭桂玲：验证工作、软件开发。陈翠翠：初稿撰写、概念构思。贾强：撰写、审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究工作的财务利益冲突或个人关系。
