《Laboratory Investigation》：Comparative Evaluation of Antibody-Oligonucleotide Conjugation Strategies for Multiplexed Imaging Applications
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本研究评估了抗体寡核苷酸修饰（AOCs）的四种方法，发现DBCO修饰法在连接效率、信号稳定性和成本效益方面最优，适用于CODEX多组学成像技术，并指出maleimide法的化学降解问题。
Chiara Caraccio|Josie van de Klashorst|Shelby Cherkas|Sara Ancel|Tim Noah Kempchen|Gustavo Vazquez|Yury Goltsev|Yu Xin Wang|Garry P. Nolan|John W. Hickey
斯坦福大学医学院微生物学与免疫学系，加利福尼亚州斯坦福
摘要
抗体寡核苷酸偶联物（AOCs）已成为多功能工具，在诊断、治疗和高维成像领域有着广泛的应用。其中一个主要应用是多路成像技术，例如通过成像共检测（CODEX），该技术可以实现对单细胞水平组织网络的可视化。在这项研究中，我们评估了四种方法——马来酰亚胺修饰、胺修饰、DBCO修饰和基于位点特异性的酶修饰方法——以优化用于多路成像应用的AOCs的制备。我们的评估重点关注了关键性能参数，包括偶联效率、信号亮度、稳定性、可重复性和成本效益。每种偶联化学方法都有效，但使用DBCO寡核苷酸的叠氮化物化学方法显示出更一致的偶联成功率和更稳定的信号保留能力。与其他协议相比，这种方法能够产生可靠的明亮图像，并且成本更为合理，这一点在全面的CODEX多路成像实验中得到了进一步验证，实验产生了可重复的空间数据。DBCO方法的稳定性和可重复性表明，它有助于减少试剂浪费和劳动力成本，同时促进更全面的抗体库的开发。这些发现表明，DBCO修饰的寡核苷酸偶联方法是生成用于多路成像的AOCs的宝贵选择，能够解决当前存在的不足，实现更一致、更广泛和更深入的多路分析。
引言
抗体寡核苷酸偶联物（AOCs）是一种强大的多模式实体，在诊断、治疗和成像等领域有着重要的应用。AOCs早在近四十年前就被首次开发出来1，近年来由于应用范围的不断扩大2，其使用量激增。例如，至少有六种AOC构建体正在进行临床试验，并且AOCs在免疫PCR3、邻近连接4或延伸5检测、蛋白质阵列和多路成像中的应用也得到了广泛开发。除了抗体-药物偶联物外，它们的抗原识别能力也被用于成像，例如通过免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）。
与寡核苷酸的偶联使得基于抗体的成像技术超越了流式细胞术、IF和IHC等传统方法所限制的少数标记物。细胞特异性DNA条形码已被广泛应用于单细胞测序<6, 7, 8, 9, 10>，并且条形码技术也在不断改进11。最近的多路蛋白质成像技术的发展现在可以实现跨数十到数百种不同标记物的空间分辨单细胞数据采集<12, 13, 14, 15, 16>。
带有寡核苷酸条形码的抗体是一系列多路成像技术的基础，包括通过共检测（CODEX）<17, 18, 19>、immune-SABER<20>、DNA交换成像（DEI）<21>和Exchange-PAINT<22>等技术，这些技术通过寡核苷酸交换实现多路成像（图1A）。这些技术产生了多维的单细胞空间数据集，促进了新的细胞类型注释技术的发展<23, 24>，并揭示了细胞间网络和细胞内的复杂相互作用（例如细胞间信号传导和运动通路<25, 26>）。这些数据还提供了对器官功能的见解，揭示了器官的亚结构（例如免疫滤泡<17>和肠隐窝<25>），并阐明了组织结构和组织模式<27>。
使用马来酰亚胺修饰的寡核苷酸进行成功偶联的成本较高且耗时较长。对于一个包含60种抗体的平均多路成像面板，至少需要60,000美元。我们和其他研究者观察到抗体-寡核苷酸偶联过程中存在变异性，因为可能需要多次尝试才能获得成功的偶联产物。以前，许多实验室使用预先修饰的马来酰亚胺偶联寡核苷酸，因为它们易于偶联；然而，马来酰亚胺基团容易发生化学降解。
AOCs在多路成像中的重要性，以及在治疗和诊断中的应用，促使人们努力优化和发现新的抗体-寡核苷酸偶联方法。对寡核苷酸的修饰可以通过赖氨酸或半胱氨酸残基以非特异性方式将其连接到抗体上。然而，对于某些IgG亚型，由于氨基酸序列上存在保守的糖基，可以采用位点特异性的偶联策略，从而将寡核苷酸连接到重链上<28>。
在这项研究中，我们评估并优化了三种非特异性的偶联化学方法和一种位点特异性的方法，用于将寡核苷酸连接到抗体上进行CODEX多路成像。我们的分析包括多个参数，如试剂可靠性、荧光强度、稳定性、一致性和成本效益。通过评估这些变量，我们旨在确定适合生成大规模抗体库用于多路成像应用的偶联策略。我们的方法有助于提供关于AOC合成的最佳试剂和协议的数据，并为选择用于复杂成像实验的广泛、高质量抗体库的方法提供了坚实的基础。
部分内容片段
抗体寡核苷酸偶联
测试了三种不同的偶联方案。平均每次可以偶联8种抗体。每次偶联迭代包括来自验证过的抗体批次和寡核苷酸批次的配对，后者作为阳性对照。如果阳性对照偶联物未能产生信号，则整个偶联批次将被丢弃。具体步骤简要描述如下：
用于将寡核苷酸连接到抗体的化学方法
为了了解灵敏度、特异性和可靠性之间的权衡，我们优化并评估了四种不同的直接非特异性偶联化学方法。我们选择这些方法是因为它们有良好的记录、易获取性以及在各个领域的应用潜力。两种方法利用了马来酰亚胺这一官能团，它可以与抗体上的巯基连接。第一种方法（方法1）通过直接修饰将马来酰亚胺连接到寡核苷酸上18, 29, 31
讨论
我们之前注意到抗体偶联质量和效率存在变异性。我们的结果表明，这主要与马来酰亚胺修饰寡核苷酸的储存有关。马来酰亚胺修饰的寡核苷酸在运输时带有2,5-二甲基呋喃环加合物保护基团，必须用甲苯和加热去除该保护基团以解保护和激活寡核苷酸进行偶联。激活过程耗时较长，并导致大量寡核苷酸损失，因此需要
作者贡献
CC和JWH构思并协调了这项研究。CC、JvdK、SC、GV、YG和JWH设计并执行了实验。SA和YXW使用叠氮化物寡核苷酸设计并执行了实验。CC、JvdK、SC、TNK和JWH分析并解释了数据，并制作了图表。CC、JvdK、SC和JWH撰写了手稿。所有作者都修订了手稿并批准了最终版本。
资助
这项工作得到了美国国立卫生研究院（P01HL108797, U01AI101984, 5U54CA209971, 5U01AI140498, U54HG010426, U19AI100627, 5P01AI131374, UH3DK114937, U19AI135976, U2CCA233238, U2CCA233195, U19AI057229, U54HG012723）；美国食品药品监督管理局（HHSF223201610018C, DSTL/AGR/00980/01）；英国癌症研究（C27165/A29073）；比尔及梅琳达·盖茨基金会（OPP1113682）；Hope Realized Medical Foundation（209477）；以及Rachford Carlotta A. Harris捐赠教席的支持
利益冲突声明
G.P.N.和Y.G.在Akoya Biosciences拥有股权，并担任其科学顾问委员会成员。Akoya Biosciences生产的试剂和仪器依赖于斯坦福大学的许可。斯坦福大学获得了美国专利9909167，该专利涵盖了本文描述的部分技术。
伦理批准和参与同意
本文中使用的所有人类样本均已去标识化，小鼠的饲养符合斯坦福大学实验室动物护理（APLAC）机构审查委员会批准的指南（协议编号33502）。所有实验均符合相关监管标准。
