《Laboratory Investigation》：HIGH EXPRESSION OF CCL2 CORRELATED WITH DENDRITIC CELL RECRUITMENT IN NEUROBLASTOMAS ASSOCIATED WITH OPSOCLONUS-MYOCLONUS SYNDROME
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神经母细胞瘤（NB）中opsoclonus-myoclonus综合征（OMS）相关低风险NB（LR-NB）因免疫微环境富含树突状细胞（DCs）而预后较好。本研究通过44例儿童NB病例的回顾性队列分析，发现OMS相关LR-NB中CCL2蛋白表达显著高于MYCN扩增型高危NB（HR-NB），且CCL2表达与DC浸润量呈正相关。RNA测序验证了LR-NB组CCL2高表达，且DC转录组特征与CCL2/CXCL12 mRNA表达存在相关性。该结果提示CCL2可能通过调控DC招募影响LR-NB预后，为靶向治疗提供新思路。
莫琳·沃兰（Maureen Voirin）、亚历克西娅·加祖（Alexia Gazeu）、贝努瓦·杜蒙（Benoit Dumont）、奥雷利安·沃西埃（Aurélien Voissière）、莱奥·雅诺（Léo Jannot）、多米尼克·普兰特扎（Dominique Plantaz）、娜塔莉·斯图姆（Nathalie Sturm）、尼古拉斯·贝尔（Nicolas Ber）、帕斯卡尔·沙斯塔涅（Pascal Chastagner）、塞西尔·皮卡德（Cécile Picard）、弗雷德里克·迪茹德（Frédérique Dijoud）、克里斯托夫·考克斯（Christophe Caux）、娜塔莉·本德里斯-韦尔马雷（Nathalie Bendriss-Vermare）、埃尔韦·萨尔特莱（Hervé Sartelet）
法国格勒诺布尔阿尔卑斯大学医院（CHU Grenoble Alpes）病理学系
摘要
神经母细胞瘤（Neuroblastoma，NB）占儿童癌症相关死亡的10%至15%。在少数情况下，NB与视神经阵挛-肌阵挛综合征（Opsoclonus-Myoclonus Syndrome，OMS）相关，这是一种神经系统的副肿瘤综合征。这些伴有OMS的低风险（Low Risk，LR）NB患者预后良好，且其肿瘤微环境富含免疫细胞。已知树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）和T淋巴细胞的招募分别由CCL2和CXCL12介导。
我们研究了肿瘤内的CCL2和CXCL12是否促进了伴有OMS的低风险NB患者微环境中DCs的招募。
我们对44名患有NB的儿童患者进行了多中心回顾性病例对照研究，这些患者中有的伴有OMS，有的没有。非OMS组被进一步分为低风险NB组和高风险（High Risk，HR）NB组，后者可能包含或不含MYCN基因扩增。我们使用抗CCL2和抗CXCL12抗体进行了免疫组化检测，并通过OPAL光谱多重免疫荧光技术对DC亚群进行了染色。免疫染色评分通过半定量光学分析得出。同时，我们还分析了公共RNAseq数据集中DC以及CCL2和CXCL12 mRNA的表达特征。
我们观察到，与含有MYCN扩增的高风险NB相比，伴有OMS的低风险NB中CCL2的蛋白质表达显著更高，而CXCL12在各NB组中的表达并无明显差异。此外，伴有OMS的低风险NB中的DC浸润更为丰富，并且与CCL2的表达呈正相关。对公共RNAseq数据的计算机分析显示，无论是否伴有OMS，低风险NB中的CCL2表达均高于高风险NB组；此外，伴有OMS的低风险NB的DC转录组特征也更为显著。我们还观察到DC基因特征与CCL2或CXCL12 mRNA表达之间存在正相关。
我们的研究结果表明，有利于DCs生长的微环境可能是伴有OMS的低风险NB患者预后良好的原因。CCL2可能是一个治疗靶点，可用于动员高风险NB或肿瘤内DCs较少的高风险NB中的DCs。
引言
神经母细胞瘤（Neuroblastoma，NB）是一种起源于自主神经系统的胚胎性肿瘤，占儿童癌症相关死亡的10%至15%（1）。NB是儿童中最常见的颅外实体瘤，通常在5岁之前被诊断出来，约占所有病例的90%（1）。NB在组织学、临床和演变方面具有高度异质性（2,3）。虽然某些肿瘤可能会自发成熟或消退，但其他肿瘤则会发展出转移特性，即使经过强化治疗仍可能导致死亡（2）。因此，NB被分为三个主要风险组：低风险（Low Risk，LR）、中等风险（Intermediate Risk，IR）和高风险（High Risk，HR）。大约一半的患者在诊断时已经出现转移。低风险NB患者的5年生存率为90%，而高风险NB患者的5年生存率为50%（4）。在约20%的原发性NB中观察到MYCN癌基因扩增，这是NB中最常见的遗传改变（5）。MYCN扩增与较差的总体预后相关，尤其是与疾病的侵袭性进展和晚期肿瘤阶段相关（5, 6）。
在极少数情况下，NB会表现为视神经阵挛-肌阵挛综合征（Opsoclonus-Myoclonus Syndrome，OMS），这是一种病因尚不完全清楚的副肿瘤神经系统综合征。OMS是一种由针对神经母细胞和神经系统共有的交叉反应性抗原（Ag）引发的自身免疫性疾病，表现出有效的抗肿瘤免疫反应（7, 8）。伴有OMS的低风险NB患者的总体生存率明显高于无OMS的NB患者（9）。伴有OMS的低风险NB的肿瘤微环境（Tumor Microenvironment，TME）总是富含免疫细胞，这些免疫细胞可以形成次级淋巴滤泡。这些淋巴滤泡中富含树突状细胞（DCs）、CD4+ T淋巴细胞、CD8+淋巴细胞和B淋巴细胞。无论是否伴有OMS，这类免疫细胞的聚集都与更好的预后相关（10, 11）。与伴有OMS的低风险NB不同，含有MYCN扩增的高风险NB缺乏免疫细胞（12），因此被称为“免疫沙漠”肿瘤，表明其肿瘤免疫原性较低（8）。因此，免疫细胞的浸润程度似乎与NB的分子表型相关。免疫细胞通过神经母细胞或其免疫和非免疫微环境产生的趋化因子被吸引到肿瘤中（13）。神经母细胞产生的CCL2和CXCL12分别促进了DCs和T淋巴细胞的招募（14, 15）。髓系DCs（myeloid DCs）是呈现抗原的细胞，对T细胞的激活和招募至关重要（16）。
本研究的目的是评估伴有或不伴有OMS的NB中肿瘤内CCL2和CXCL12的表达情况以及DCs的浸润情况。我们对含有或不含MYCN扩增的高风险NB患者以及伴有或不伴有OMS的低风险NB患者进行了多中心回顾性病例对照研究。我们的原位分析显示，伴有OMS的低风险NB中CCL2的表达高于含有MYCN扩增的高风险NB。我们还通过对包含OMS患者在内的公共RNAseq数据集进行计算机分析，验证了这些观察结果。我们的发现强调了趋化因子在动员肿瘤内DCs以改善免疫治疗方面的潜在价值。
患者和样本
患者和样本
这项涉及人类数据和样本的非干预性多中心回顾性病例对照研究遵循了现行国家法规，并符合参考方法编号004（MR4）。所有患者的法定代表均已获知研究内容且未提出反对意见。我们回顾性地选择了44份经甲醛固定、石蜡包埋（FFPE）的NB样本，这些样本主要来自未经治疗的患者。
患者和样本
纳入伴有OMS的低风险NB病例组（n=11）的患者主要为女性（7/11），其中6名患者年龄在18个月及以上，诊断时的中位年龄为18个月（表2）。所有患者均为局部病变，病变阶段为L1期（n=4）或L2期（n=7）。所有患者在最后一次随访时均存活。未伴有OMS的低风险NB患者（n=11）主要为男性（8/11），年龄大多在18个月以下（7/11），诊断时的中位年龄为5个月。
讨论
我们之前通过体外实验发现CCL2/CCR2轴在单核细胞和DCs向MYCN非扩增NB招募中起重要作用（14）。在本研究中，我们分析了不同风险组患者（包括免疫丰富的伴有OMS的低风险亚组）中CCL2和CXCL12趋化因子的表达情况以及肿瘤内DCs的存在情况。我们进行了病例对照研究，病例组包括被诊断为伴有OMS的患者。
致谢
我们感谢格勒诺布尔阿尔卑斯大学、里昂大学医院、IHOPe和莱昂·贝拉德癌症中心以及南锡布拉博瓦大学医院的儿科肿瘤学部门的所有工作人员。
本研究得到了萨瓦抗癌联盟委员会（Comité de la Savoie de la Ligue Contre le Cancer）、法国儿童和青少年癌症与白血病协会（Société Fran?aise de Lutte contre les Cancers et les leucémies de l’enfant et de l’adolescent，SFCE）、布里斯托尔迈尔斯施贵宝基金会（Bristol Myers Squibb Foundation）以及PLAsCAN融合研究所（Institut Convergence PLAsCAN）的资助（资助编号
