复合水凝胶调节调节性T细胞介导的骨免疫调节作用，从而改善由类固醇引起的股骨头骨坏死

《Materials & Design》：Composite hydrogel modulates regulatory T cell-mediated osteoimmunomodulatory osteogenesis for steroid-induced osteonecrosis of the femoral head

本研究开发了一种新型功能化水凝胶MSIL-2/nHA@GelCCL22，通过释放IL-2和CCL22招募并激活调节性T细胞（Tregs），促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）骨向分化、巨噬细胞M2极化及血管内皮细胞（HUVECs）血管化，有效修复激素性股骨头坏死（SONFH）模型中的骨损伤。实验表明，该水凝胶能显著提升骨体积分数（BV/TV）、骨矿物质密度（BMD）及血管生成相关指标（CD31、VEGF表达），并通过机制研究证实JAK3/STAT5/Foxp3信号通路在Tregs激活中的作用。

　　本研究提出了一种新型的可注射功能性水凝胶MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22，旨在解决股骨头缺血性坏死（SONFH）治疗中的一些关键问题。SONFH是一种常见的临床病症，尤其在长期使用糖皮质激素（GCs）的患者中更为常见。如果不及时干预，SONFH会导致股骨头塌陷，从而需要进行全髋关节置换术（THA）。然而，THA不仅成本高昂，而且伴随着较高的术后并发症风险，如假体周围感染、无菌性松动以及需要再次手术的风险。因此，早期治疗SONFH显得尤为重要，以避免股骨头塌陷和推迟或避免THA手术。

在当前的治疗方法中，钻孔减压结合自体骨移植是一种常用的手段。然而，这种自体骨移植方法存在一些限制，如额外的创伤、感染风险增加以及手术时间延长等。这些因素限制了其在临床中的广泛应用。因此，许多研究试图用生物材料替代自体骨移植，以减轻这些不良影响。然而，现有研究多集中在调节成骨效应细胞，忽视了糖皮质激素引起的骨坏死区域免疫微环境的破坏。

调节性T细胞（T_regs）在骨坏死区域的免疫调节中起着至关重要的作用。它们通过分泌转化生长因子-β（TGF-β）促进关键因子如runt相关转录因子2（Runx2）、碱性磷酸酶（ALP）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达，从而增强成骨和血管生成。此外，T_regs还能通过释放白细胞介素-10（IL-10）促使巨噬细胞从促炎性的M1表型向抗炎性的M2表型极化。M2巨噬细胞会分泌VEGF和TGF-β等细胞因子，促进组织修复。然而，在糖皮质激素的作用下，T_regs的数量减少，功能受到抑制，这会妨碍BMSCs的成骨分化和巨噬细胞的M2极化，导致局部炎症加重，从而延缓骨修复过程。

本研究开发了一种具有双重细胞因子释放能力的水凝胶MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22，它能够释放CCL22和IL-2，从而招募并激活T_regs，通过JAK3/STAT5/Foxp3信号通路发挥作用。这种干预手段促进了巨噬细胞的M2极化，增强了BMSCs的成骨分化，并促进了HUVECs的血管生成。在兔子SONFH模型中，植入MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22有效促进了T_regs的迁移，刺激了成骨和血管生成，并促进了股骨头的修复。综上所述，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22通过招募和激活T_regs，增强了成骨免疫调节过程，为SONFH的早期治疗提供了一种新的策略。

### 1. 引言

股骨头缺血性坏死（ONFH）是骨科领域中一种常见且具有挑战性的疾病，其发病率在不断上升。在美国，每年有超过20,000人受到影响，而在我国，累计受影响的人数已超过800万。其中，由糖皮质激素引起的ONFH（SONFH）占所有ONFH病例的25%以上。如果不及时干预，大多数SONFH病例会发展为股骨头塌陷，从而需要进行全髋关节置换术（THA）。然而，THA不仅费用高昂，还伴随着显著的手术风险，包括假体周围感染、无菌性松动以及需要再次手术的可能性。因此，对SONFH进行早期干预显得尤为重要，以防止股骨头塌陷并减少THA的需求。

在当前的治疗手段中，钻孔减压结合自体骨移植是早期SONFH治疗的一种常见方法。然而，自体骨移植存在一些局限性，如额外的创伤、感染风险增加以及手术时间延长。因此，许多研究尝试用生物材料替代自体骨移植，以减少这些不良影响。然而，现有的骨修复材料主要关注于调节成骨效应细胞，而忽视了糖皮质激素导致的骨坏死区域免疫微环境的破坏。

调节性T细胞（T_regs）是关键的免疫调节因子，它们通过分泌TGF-β等细胞因子，促进关键的成骨因子如Runx2、ALP和VEGF的表达，从而增强成骨和血管生成。此外，T_regs还能通过释放IL-10促使巨噬细胞从促炎性的M1表型向抗炎性的M2表型极化。M2巨噬细胞会分泌VEGF和TGF-β等细胞因子，促进组织修复。然而，在糖皮质激素的作用下，T_regs的数量减少，功能受到抑制，这会妨碍BMSCs的成骨分化和巨噬细胞的M2极化，导致局部炎症加重，从而延缓骨修复过程。

### 2. 方法

#### 2.1. T_regs的分离、鉴定和培养

T_regs的分离和鉴定采用CD4⁺CD25⁺调节性T细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec，德国）和autoMACS? Pro分选器（Miltenyi Biotec，德国），按照制造商的说明进行操作。T_regs的培养使用含有rhIL-2、青霉素-链霉素和胎牛血清（FBS）的完全培养基，通过预负载的CD3/CD28抗体磁珠进行激活，磁珠与细胞的比例为3:1，7天后调整为1:1。

#### 2.2. T_regs的抑制作用评估

T_regs的抑制功能通过混合淋巴细胞反应（MLR）实验进行评估。实验分为六组，每组含有1×10⁶ T_eff细胞，其中T_eff细胞与T_regs以及磁珠的比例不同。通过流式细胞术（FACS）检测CFSE荧光强度，比较T_eff细胞的增殖率。

#### 2.3. MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22的制备

MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22的制备过程包括GelMA微球（MS）的灭菌、rhIL-2溶液的制备、nHA的加入以及最终的光固化。MS在405 nm光照射下形成水凝胶，释放IL-2和CCL22，促进T_regs的招募和激活。

#### 2.4. 水凝胶的表征

水凝胶的表征包括FTIR、XRD和TEM，用于分析其化学结构、晶体结构和形态。GelMA、nHA@Gel和MS/nHA@Gel的形成通过旋转流变仪进行测试，而其形态则通过扫描电子显微镜（SEM）进行观察。

#### 2.5. 水凝胶的膨胀实验

水凝胶的膨胀实验通过测量其在不同时间点的膨胀率（SR）来评估其吸水能力。实验中，水凝胶在37°C的PBS中溶解，每隔30分钟记录一次质量变化，计算SR。

#### 2.6. 水凝胶的降解实验

水凝胶的降解实验通过测量其在不同时间点的降解率（DR）来评估其生物降解性。水凝胶在含有0.1 mg/mL II型胶原酶的PBS中降解，每隔20分钟记录一次质量变化，计算DR。

#### 2.7. 水凝胶的体外生物相容性

通过体外生物相容性实验评估MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22的细胞毒性。实验中，T_regs在含有水凝胶的96孔板中培养，通过Live-Dead染色和CCK-8实验评估细胞活性和增殖情况。

#### 2.8. IL-2和CCL22的体外释放测试

通过ELISA检测IL-2和CCL22的释放情况，以评估水凝胶的控释能力。实验中，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22在30天内持续释放两种细胞因子。

#### 2.9. T_regs的趋化能力检测

通过Transwell实验评估T_regs的趋化能力。实验中，T_regs被接种在含有水凝胶的上室中，通过检测下室中的细胞数量和形态来评估其迁移能力。

#### 2.10. 水凝胶激活T_regs的机制研究

通过RT-qPCR和Western blot（WB）检测JAK3、STAT5、Foxp3、IL-1、IL-10和TGF-β的表达水平，以评估水凝胶对T_regs激活的影响。实验中，T_regs与不同水凝胶共培养，检测其对T_regs的激活效果。

#### 2.11. 水凝胶对BMSCs成骨分化的影响

通过ALP染色、ARS染色和油红O染色评估BMSCs的成骨分化能力。实验中，T_regs与水凝胶共培养，其上清液用于BMSCs的培养，观察其成骨分化情况。

#### 2.12. 水凝胶对巨噬细胞极化的影响

通过免疫荧光染色和RT-qPCR检测巨噬细胞的极化情况。实验中，T_regs与水凝胶共培养，其上清液用于Raw264.7细胞的培养，观察其极化情况。

#### 2.13. 水凝胶对HUVEC血管生成的影响

通过管形成实验和划痕实验评估HUVEC的血管生成能力。实验中，T_regs与水凝胶共培养，其上清液用于HUVEC的培养，观察其血管生成情况。

#### 2.14. 兔子SONFH模型的建立

所有实验动物均按照国家关于实验动物人道使用和护理的指南进行饲养，并获得四川大学华西医院动物伦理委员会的批准。实验中，30只新西兰白兔被注射甲基强的松龙，以建立SONFH模型，同时注射青霉素以防止感染。

#### 2.15. 分组和手术

30只兔子被随机分为五组：MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组、MS^IL-2/nHA@Gel组、MS/nHA@Gel^CCL22组、MS/nHA@Gel组和空白对照组。每组6只兔子，每只兔子12个股骨头。手术过程包括麻醉、切口、股骨头钻孔减压以及水凝胶的植入。

#### 2.16. 微CT分析

术后4周和8周，对股骨头进行微CT扫描，以评估新骨形成情况。扫描结果以DICOM和BMP格式导出，并使用Mimics Medical 21.0软件进行3D重建。同时，使用SkyScan的CTAn 1.10软件分析骨体积/组织体积（BV/TV）、骨小梁分离（Tb.Sp）、骨矿密度（BMD）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）等参数。

#### 2.17. 组织学分析

对骨组织进行HE和Masson三色染色，以评估新骨形成和血管生成情况。同时，对肝脏、脾脏和肾脏组织进行HE染色，以评估水凝胶对这些器官的潜在毒性。

#### 2.18. 统计分析

使用IBM SPSS Statistics 26进行统计分析，数据以均值±标准差表示。两组之间的比较使用独立样本t检验，多组比较使用单因素方差分析（ANOVA）并进行事后Bonferroni检验。统计显著性设定为P < 0.05。

### 3. 结果

#### 3.1. T_regs和BMSCs的制备与鉴定

T_regs和BMSCs的制备与鉴定结果在补充材料中展示（Figs. S1–S4）。

#### 3.2. MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22的表征

GelMA、nHA@Gel和MS/nHA@Gel的形态在SEM图像中显示（Fig. S5）。在25°C和12分钟的检测时间内，所有水凝胶组的储能模量（G'）均高于损耗模量（G"），表明其形成了凝胶（Fig. 2B）。水凝胶的膨胀率无显著差异，平衡状态在约150分钟内达到（Fig. 2C）。降解率在各组之间也无显著差异（Fig. 2D）。MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22在30天内持续、线性释放IL-2和CCL22（Fig. 2E）。SEM图像显示GelMA具有多孔结构，未加载药物的MS直径约为150 nm，而加载药物的MS^IL-2直径减小至约100 nm。nHA和MS与多孔GelMA良好结合，形成MS/nHA@Gel组用于后续实验。

#### 3.3. 水凝胶对T_regs生物相容性的研究

Live-Dead染色（Fig. 2F）显示，所有组在1、3和7天内的细胞活性均较高。CCK-8实验（Fig. 2G）显示，所有组的细胞增殖能力均较强。其中，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组和MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组表现出最高的细胞活性。

#### 3.4. 水凝胶释放CCL22促进T_regs的招募

如图3所示，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组的下室细胞数量显著高于MS/nHA@Gel^CCL22组，其次是CCL22溶液组，具有统计学意义。MS^IL-2/nHA@Gel组和MS/nHA@Gel组的细胞数量无显著差异，且最低。总体而言，能够释放CCL22的水凝胶促进了T_regs的招募，实验结果与下室的细胞数量一致。

#### 3.5. 水凝胶释放IL-2激活JAK3/STAT5/Foxp3通路并促进T_regs的扩增

如图4所示，T_regs在SEM图像中表现出在水凝胶表面的集群生长，且在所有组中均随时间推移而扩增。释放IL-2的水凝胶促进了T_regs的扩增。RT-qPCR和WB结果显示，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组和MS^IL-2/nHA@Gel组的JAK3、STAT5、Foxp3、IL-10和TGF-β的表达水平均高于其他组。同时，IL-1的表达水平较低，表明IL-2的释放激活了JAK3/STAT5/Foxp3通路并促进了T_regs的扩增。

#### 3.6. T_regs与水凝胶共培养促进了BMSCs的增殖和成骨分化

在T_regs与水凝胶共培养后，各组的上清液用于BMSCs的培养。通过ARS染色和ALP染色评估钙结节的形成和ALP的分泌。MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组和MS^IL-2/nHA@Gel组表现出最多的钙结节（Fig. 5A, E），ALP表达也最高（Fig. 5B, F）。通过划痕实验评估BMSCs的迁移能力，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组和MS^IL-2/nHA@Gel组在24小时后表现出最大的迁移和增殖区域（Fig. 5C, G）。ALP免疫荧光染色确认了这些组的ALP荧光强度较高（Fig. 5D, H）。RT-qPCR进一步检测了Runx2和ALP的mRNA表达水平，结果显示MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组和MS^IL-2/nHA@Gel组的Runx2和ALP表达水平均高于其他组（Fig. 5I, J）。总体而言，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组和MS^IL-2/nHA@Gel组表现出最多的钙结节、最高的ALP和Runx2表达水平，以及最大的BMSC迁移区域。

#### 3.7. T_regs与水凝胶共培养诱导巨噬细胞向M2表型极化

在T_regs与水凝胶共培养后，各组的上清液用于Raw264.7细胞的培养，通过免疫荧光检测M1标记物iNOS和M2标记物CD206的表达。MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组和MS^IL-2/nHA@Gel组的CD206荧光强度最高，而控制组最低（Fig. 6B）。相反，iNOS荧光强度在MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组和MS^IL-2/nHA@Gel组最低，控制组最高（Fig. 6C）。RT-qPCR结果显示，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组和MS^IL-2/nHA@Gel组的M1标记物CCR7表达水平较低，而M2标记物Arg1的表达水平较高（Fig. 6E, D）。总体而言，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组和MS^IL-2/nHA@Gel组表现出最低的iNOS和CCR7表达水平，以及最高的CD206和Arg1表达水平，表明T_regs与水凝胶共培养诱导了巨噬细胞向M2表型的极化。

#### 3.8. T_regs与水凝胶共培养促进了HUVEC的血管生成和增殖

在T_regs与水凝胶共培养后，各组的上清液用于HUVEC的培养，通过管形成实验和划痕实验评估其血管生成和迁移能力。管形成实验中，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组和MS^IL-2/nHA@Gel组的连接数（Nb junctions）和分支数（Nb branches）最高（Fig. 7A, D）。划痕实验显示，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组和MS^IL-2/nHA@Gel组在24小时后表现出最大的迁移和增殖区域（Fig. 7B, E）。VEGF的免疫荧光染色显示，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组和MS^IL-2/nHA@Gel组的VEGF荧光强度最高（Fig. 7C, F）。RT-qPCR分析显示，这些组的VEGF和CD31表达水平均高于其他组（Fig. 7G, H）。总体而言，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组和MS^IL-2/nHA@Gel组表现出最高的VEGF和CD31表达水平，以及最大的HUVEC迁移区域。

#### 3.9. SONFH模型的建立、股骨头钻孔减压及水凝胶植入

HE染色用于评估SONFH模型中空骨陷窝的形成。如图S7A所示，模型组中观察到大量空骨陷窝，空骨陷窝率（EBLR）为77.33% ± 9.26%。相比之下，空白组的空骨陷窝率仅为8.26% ± 2.31%。两组之间的差异具有统计学意义（P = 0.012）。6周后，30只兔子被随机分配到五组：MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组、MS^IL-2/nHA@Gel组、MS/nHA@Gel^CCL22组、MS/nHA@Gel组和空白组。详细的手术过程在方法部分中描述。

#### 3.10. 水凝胶植入后的微CT分析

如图8A和B所示，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组表现出最多的新生骨组织。MS^IL-2/nHA@Gel组和MS/nHA@Gel^CCL22组的新生骨组织量与MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组相比较低，而MS/nHA@Gel组最低。空白组的新生骨组织量最少。定量分析显示，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组在4周和8周后的BMD和BV/TV最高。同时，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组的Tb.N和Tb.Th最高，而其他组的数值较低。此外，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组的Tb.Sp最低，而MS^IL-2/nHA@Gel组、MS/nHA@Gel^CCL22组和空白组的Tb.Sp较高。

#### 3.11. HE和Masson染色的组织形态分析

术后4周，所有组均观察到新生骨和血管样结构（Fig. 9A）。空白组的股骨头区域中，骨陷窝较少，新生骨面积最小，血管样结构也最少。MS/nHA@Gel组的股骨头区域中，观察到少量新生骨和较多的血管样结构。MS^IL-2/nHA@Gel组和MS/nHA@Gel^CCL22组的新生骨面积和血管样结构均高于MS/nHA@Gel组，而MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组表现出最密集的骨陷窝、最大的新生骨面积和最多的血管样结构。术后8周，所有组的水凝胶均实现了骨整合，观察到更多的骨陷窝和血管样结构（Fig. 9B）。空白组的骨陷窝最少，新生骨面积和血管样结构也最少。相比之下，MS^IL-2/nHA@Gel组、MS/nHA@Gel^CCL22组和MS/nHA@Gel组的骨陷窝较多，新生骨面积和血管样结构也较多。其中，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组表现出最密集的骨陷窝、最大的新生骨面积和最多的血管样结构。

#### 3.12. 成骨和血管生成指标的免疫组化分析

成骨标志物Runx2和ALP的表达在4周和8周后通过免疫组化分析。如图10A所示，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组的Runx2和ALP表达水平最高，其次是MS^IL-2/nHA@Gel组和MS/nHA@Gel^CCL22组，MS/nHA@Gel组的表达水平较低，空白组最低。血管生成标志物VEGF和CD31的表达在4周和8周后通过免疫组化分析。如图10B所示，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组的VEGF和CD31表达水平最高，其次是MS^IL-2/nHA@Gel组和MS/nHA@Gel^CCL22组，MS/nHA@Gel组和空白组的表达水平较低。总体而言，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22组在促进T_regs迁移、激活、成骨免疫调节、成骨和血管生成方面表现最佳。

### 4. 讨论

T_regs是重要的免疫调节因子，在免疫系统调节、炎症缓解和组织修复中起关键作用。目前关于T_regs调节的研究主要集中在免疫相关疾病，如肿瘤免疫治疗、器官移植、1型糖尿病、心肌梗死、牙周炎、干眼病和炎症性肠病等。然而，关于T_regs在骨坏死修复中的应用研究较少。传统的骨修复材料在植入骨坏死区域的炎症环境中可能无法达到最佳的修复效果。因此，本研究的创新之处在于利用简单的、常见的材料合成一种能调节T_regs的复合水凝胶，从而改善成骨免疫调节环境，促进骨修复。

本研究中，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22通过释放CCL22和IL-2，促进了T_regs向骨坏死区域的迁移和激活。其通过与BMSCs和巨噬细胞的相互作用，促进了BMSCs的成骨分化、巨噬细胞向M2表型的极化以及HUVEC的血管生成，最终实现了骨坏死的修复。这一研究为SONFH的早期治疗提供了一种新的策略，通过调节T_regs实现成骨免疫调节。

然而，本研究仍存在一些局限性。首先，未评估不同浓度的GCs对T_regs的抑制作用。但正如前所述，本研究的基础是基于已有研究中GCs对T_regs活性的抑制作用及其对成骨免疫调节的影响。此外，动物实验显示，MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22在兔子SONFH模型中有效促进了T_regs的迁移、激活、成骨免疫调节、成骨和血管生成。其次，在体外实验中，我们使用了不同动物来源的细胞。未来研究中，应尽可能使用同种动物来源的细胞以提高实验的一致性。第三，尽管本研究显示T_regs在体外促进了BMSCs的成骨分化、巨噬细胞向M2表型的极化以及HUVEC的血管生成，但尚未完全验证其在复杂微环境中具体的调节机制。未来的研究可以进一步探讨T_regs的调节作用，并验证其在复杂微环境中的调节效果，从而提供更充分的因果证据。

### 5. 结论

综上所述，通过MS^IL-2/nHA@Gel^CCL22释放CCL22和IL-2，T_regs被招募到骨坏死区域并被激活。它们与BMSCs和巨噬细胞的相互作用促进了BMSCs的成骨分化、巨噬细胞向M2表型的极化、HUVEC的血管生成，最终实现了骨坏死的修复。本研究为SONFH的早期治疗提供了一种新的策略，通过调节T_regs实现成骨免疫调节。