采用绿色分析化学原理，对LC-QQQ-MS/MS方法开发进行战略性研究，以实现同时定量戒烟药物伐伦克林（varenicline）中四种潜在的遗传毒性杂质

《Microchemical Journal》：A strategic approach to LC-QQQ-MS/MS method development for simultaneous quantification of four potential genotoxic impurities in smoke cessation drug varenicline, applying green analytical chemistry principles

基因毒性杂质检测与绿色分析方法研究：varenicline PGIs的(Q)-SAR分类与LC-QQQ-MS/MS方法开发。

　　随着全球对健康和环境问题的关注不断提升，药物研发和生产过程中对潜在有害杂质的识别与控制变得愈加重要。特别是对于那些具有基因毒性的杂质（PGIs），它们可能在药物合成过程中形成，并且即使在极低浓度下也可能对人类健康产生严重影响。因此，开发一种能够准确、高效且环境友好的分析方法，以检测和量化这些基因毒性杂质，已成为制药行业的重要课题。本文介绍了一种基于液相色谱-三重四极杆质谱（LC-QQQ-MS/MS）的新型分析方法，用于同时检测和量化Varenicline（VRN）药物物质（DS）和药物制剂（DP）中四种潜在基因毒性杂质，这些杂质在VRN的合成过程中可能产生，并且对药物的安全性构成威胁。

### 1. 背景与重要性

全球疾病负担（GBD）研究指出，烟草吸烟导致超过800万人死亡，这突显了开发和实施有效戒烟疗法的紧迫性。Varenicline作为一种FDA批准的成年戒烟辅助药物，因其对大脑中α4β2烟碱乙酰胆碱受体的作用而受到关注。该药物不仅能够帮助减少吸烟欲望，还能通过阻断尼古丁的效果，降低吸烟带来的满足感。此外，VRN还被用于治疗干眼症（DED），其鼻喷剂形式（Tyrvaya）能够刺激鼻黏膜中的烟碱乙酰胆碱受体，从而激活副交感神经通路，促进泪液分泌并缓解患者的症状。尽管VRN在临床应用中表现出良好的安全性和有效性，但在其合成过程中仍可能产生多种潜在基因毒性杂质（PGIs），这些杂质可能来源于合成试剂、中间体、副产物或储存过程中。这些杂质的存在可能对药物的安全性产生不利影响，因此，对其进行严格控制和检测至关重要。

在药物研发过程中，PGIs的管理已成为一项核心任务。监管机构如美国食品药品监督管理局（FDA）、国际人用药品注册技术协调会（ICH）和欧洲药品管理局（EMA）已制定了相应的指导方针，以确保药物在生产和使用过程中的安全性。其中，ICH M7（R2）指南强调了使用定量结构-活性关系（QSAR）方法预测药物物质的基因毒性潜力，并结合专家规则和统计模型进行综合评估。这一方法的应用不仅有助于早期识别潜在的有害杂质，还能为后续的控制策略提供科学依据。因此，对于VRN的PGIs进行系统性评估和检测，对于保障药物安全性和符合监管要求具有重要意义。

### 2. 研究目标与方法

本研究的主要目标是开发一种绿色、高灵敏度的LC-QQQ-MS/MS方法，用于同时检测和量化VRN药物物质和制剂中的四种潜在基因毒性杂质。这四种杂质——VRN-PGI-1、VRN-PGI-2、VRN-PGI-3和VRN-PGI-4——在VRN的合成过程中可能形成，并且其结构特征表明它们具有潜在的基因毒性风险。目前，市场上尚无同时检测这四种杂质的分析方法，因此，本研究提出了一个创新的解决方案。

为了实现这一目标，研究团队遵循了ICH Q14和ICH Q2（R2）的最新指南，对方法的性能进行了全面的评估。该方法不仅需要满足高灵敏度和选择性的要求，还应具备良好的稳定性、重现性和可重复性。此外，为了确保方法的环境友好性，研究团队还引入了多种绿色分析化学（GAC）评估工具，包括Analytical Eco-Scale（AES）、Analytical Greenness（AGREE）、Modified Green Analytical Procedure Index（MoGAPI）和Blue Applicability Green Index（BAGI）。这些工具的应用有助于全面评估方法的环境影响，并确保其符合当前可持续发展的趋势。

### 3. 方法开发与优化

在方法开发过程中，研究团队首先对四种PGIs的结构进行了详细分析，并利用QSAR方法预测其基因毒性潜力。通过两种互补的QSAR模型，所有四种杂质均被分类为ICH M7（R2）中的Class-3，表明它们具有较高的基因毒性风险。基于这一结果，研究团队设计了一种LC-QQQ-MS/MS方法，以确保能够准确检测和量化这些杂质。

为了优化分析条件，研究团队首先对流动相进行了筛选，最终选择了0.1%甲酸水溶液和乙腈的混合物作为流动相。这种选择不仅提高了方法的灵敏度，还减少了溶剂的使用量，从而降低了环境负担。随后，研究团队对色谱分离条件进行了优化，包括柱子的选择、流速的调整以及梯度程序的设定。最终，Waters Acquity HSS T3 C18柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）被确定为最佳选择，因为它能够提供良好的分离效果，并且能够减少杂质之间的干扰。

在质谱条件的优化过程中，研究团队采用了多反应监测（MRM）模式，并通过调整碰撞能量（CE）和锥电压（CV）等参数，确保了每种杂质都能获得稳定的信号。为了进一步提高方法的灵敏度，研究团队对样品前处理步骤进行了优化，包括使用0.22 μm的过滤膜和超声波处理，以确保杂质能够完全溶解并减少基质效应的影响。此外，为了提高方法的鲁棒性，研究团队还应用了分数因子设计（fractional factorial design）方法，对关键方法参数进行了系统性评估，确保方法在不同条件下的稳定性和可靠性。

### 4. 方法验证与性能评估

为了确保方法的科学性和实用性，研究团队对LC-QQQ-MS/MS方法进行了全面的验证。验证过程包括对方法的特异性、检测限（DL）、定量限（QL）、线性范围、准确性和精密度等关键性能指标的评估。特异性测试表明，该方法能够在复杂的基质中准确识别四种PGIs，且无显著的干扰峰。检测限和定量限的评估结果显示，该方法能够检测和量化四种PGIs在0.1至1.5 μg/g的浓度范围内，满足实际应用中的需求。

线性研究表明，该方法在0.3至1125 ng/mL的范围内表现出良好的线性响应，且相关系数（R）均高于0.99，表明方法的定量能力非常可靠。精密度测试显示，该方法在重复性和中间精密度方面均表现出优异的性能，其变异系数（CV）均低于10%，进一步验证了方法的稳定性。此外，准确度测试表明，该方法在不同浓度水平下均能实现较高的回收率，且其结果符合预定义的接受标准。

在基质效应的评估中，研究团队发现该方法在实际样品基质中的表现与溶剂基质中的表现相似，表明基质对信号的影响较小，方法的准确性得到了保障。同时，该方法还成功应用于三种商业化的VRN片剂，所有样本均未检测到四种PGIs，证明其在实际应用中的可行性。

### 5. 绿色分析化学评估

为了进一步验证该方法的环境友好性，研究团队采用了多种绿色分析化学评估工具，包括AES、AGREE、MoGAPI和BAGI。这些工具的应用不仅有助于量化方法的环境影响，还能为方法的可持续性提供科学依据。根据AES评估，该方法在环境性能方面表现良好，总得分为73，表明其在生态和职业健康方面具有较低的风险。AGREE工具的评估结果显示，该方法在绿色分析化学的十二项原则中表现出较高的合规性，得分为0.62，表明其在资源利用、废物处理和能耗等方面均符合绿色分析的要求。

MoGAPI工具的评估进一步确认了该方法的环境可持续性，得分为70，表明其在低危害溶剂使用、低能耗和废物最小化方面表现优异。BAGI工具的评估结果显示，该方法在环境兼容性方面得分为72.5，表明其在实际应用中具有较高的可行性。综合来看，该方法不仅在技术性能上表现出色，还在环境可持续性方面得到了充分的验证，符合当前制药行业对绿色化学和可持续发展的要求。

### 6. 方法的适用性与未来展望

本研究开发的LC-QQQ-MS/MS方法不仅能够准确检测和量化VRN药物物质和制剂中的四种潜在基因毒性杂质，还具备良好的灵敏度、选择性和稳定性。此外，该方法在环境友好性方面表现出色，符合当前绿色化学的发展趋势。这为制药企业提供了新的工具，以确保其产品质量和安全性，同时减少对环境的影响。

未来，随着对基因毒性杂质研究的深入，以及对绿色分析方法需求的增加，本研究的方法有望成为制药行业的一个重要参考。同时，该方法的成功应用也为其他药物的基因毒性杂质检测提供了新的思路和方向。此外，随着分析技术的不断进步，该方法还可以进一步优化，以提高检测效率和降低分析成本。这些改进不仅有助于提高药物质量，还能推动制药行业向更加可持续的方向发展。