黑色素瘤发展过程中转移前微环境中的淋巴引流管中小胞外囊泡的蛋白质组学分析

《Molecular & Cellular Proteomics》：Proteomic analysis of small extracellular vesicles from lymphatic affluents in developing premetastatic niche in melanoma

本研究通过多组学分析发现，黑色素瘤患者引流淋巴液中的外泌体携带CD38、Galectin-9和Tenascin C等蛋白，这些蛋白通过免疫调节和基质重塑促进前转移生 niche的形成，并与患者生存率相关。

　　这项研究深入探讨了黑色素瘤患者淋巴系统中的小外泌体（sEVs）在形成转移前微环境（PMN）中的作用。黑色素瘤是一种侵袭性强的皮肤癌，常通过淋巴结（LNs）转移至局部或远处器官。其中，首站淋巴结（SLN）作为肿瘤细胞转移的早期靶点，其在转移前的免疫环境变化对于理解PMN的形成至关重要。sEVs作为细胞间通信的载体，能够通过淋巴系统将致癌信号传递至SLN，从而改变其免疫微环境，促进黑色素瘤细胞的定植。

研究人员对来自黑色素瘤患者的引流淋巴管sEVs进行了多组学分析，与非癌症相关的引流淋巴管sEVs以及术后淋巴液中的sEVs进行了比较。通过使用串联质谱标签（TMTpro）标记和质谱分析，他们识别出595种新的sEV蛋白，比ExoCarta数据库中报道的蛋白数量更多。此外，相较于之前三个淋巴来源的EVs数据集，他们还发现了1003种新的蛋白。分析结果显示，有145种差异表达蛋白（DEPs）在黑色素瘤sEVs中显著改变，这些蛋白与细胞应激、损伤途径的增加以及细胞外基质（ECM）组织的减少有关。

为了进一步了解这些差异表达蛋白的功能，研究团队对前50种DEPs进行了跨多个组学数据集的表达分析，包括正常、原发和转移性样本。通过层次聚类分析，他们发现有9种蛋白在黑色素瘤sEVs中上调，而2种蛋白下调，这些蛋白与黑色素瘤进展相关。值得注意的是，一些与黑色素瘤和术后样本共有的蛋白与伤口愈合机制有关，这表明sEVs可能在调节免疫反应和促进组织修复过程中发挥双重作用。

研究还通过多重免疫荧光分析（MxIF）对选定的蛋白进行了表达水平的评估，发现CD38、半乳糖凝集素9（LGALS9）和十烷基化蛋白C（TNC）在黑色素瘤患者SLN的淋巴窦中显著上调，而在对照组SLN中则表达较低。其中，LGALS9在LN组织中的高表达与黑色素瘤患者的较差总生存率相关。这表明，这些蛋白可能作为预测疾病进展的生物标志物。

在实验方法上，研究团队采用了严格的sEV分离流程，包括使用qEV1 70nm柱进行尺寸排阻色谱，以及使用30kDa的细胞素柱进行浓缩。通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM）确认了sEV的大小和形态特征。此外，通过Western blot分析验证了sEV标志物如CD9、ALIX和syntenin-1的存在，并排除了血浆和细胞来源的污染。

在数据分析方面，研究团队采用了统计方法和生物信息学工具，如Ingenuity Pathway Analysis（IPA）、Gene Ontology（GO）分析、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析，以及STRING数据库进行蛋白质相互作用网络分析。这些方法帮助他们识别了与黑色素瘤相关的信号通路，如PD-1/PD-L1检查点通路、Th1/Th2细胞分化通路，以及与ECM组织和伤口愈合相关的通路。

研究还发现，黑色素瘤相关的sEV蛋白在术后淋巴液中表现出不同的表达模式，这可能与手术后的组织修复过程有关。此外，通过比较黑色素瘤和非黑色素瘤样本的蛋白表达，研究人员识别出一些可能作为生物标志物的蛋白，如CD38、LGALS9和TNC。这些蛋白在SLN的淋巴窦中显著上调，并且在术后淋巴液中也表现出较高的表达水平，这可能反映了其在转移前微环境形成中的重要作用。

该研究的意义在于揭示了黑色素瘤通过淋巴系统传递的sEV蛋白如何影响SLN的免疫环境，从而促进转移前微环境的形成。这些发现不仅加深了我们对黑色素瘤转移机制的理解，还为未来的临床应用提供了潜在的生物标志物，如CD38、LGALS9和TNC。通过检测这些蛋白的表达水平，可能有助于评估患者的转移风险，并指导术后监测和治疗策略的制定。此外，这些sEV蛋白可能成为开发新型免疫疗法或靶向治疗的潜在靶点，以干预黑色素瘤的转移过程。