将酶替代疗法通过聚焦超声传递至Gaa?/?庞贝病小鼠的大脑

《Molecular Genetics and Metabolism》：Focused ultrasound delivery of enzyme replacement therapy to the brain of Gaa?/? Pompe disease mice

酶替代疗法联合聚焦超声血脑屏障开放治疗庞贝病小鼠模型的糖原代谢研究。通过对比MRI验证超声开放血脑屏障（BBB）效果，发现BBB开放后重组人α-葡萄糖苷酶（rhGAA）能显著降低小鼠大脑皮质和纹状体区域糖原沉积水平，生化检测显示酶活性提升。未来将探索该技术对疾病下游病理的干预潜力及临床转化价值。

　　

Paige Nowlin|Yongzhi Zhang|Amanda Chrisholm|Haoyue Zhang|Jian Dai|Bernie Simone Owusu-Yaw|Sarah P. Young|Deeksha Bali|Jaymin Upadhyay|Nick Todd

美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院布里格姆妇女医院放射科

摘要

临床应用的酶替代疗法（ERTs）在缓解婴儿期发病（IOPD）和晚发型发病（LOPD）庞贝病（PD）患者的外周组织病理方面取得了成功。然而，目前尚无任何获批的疗法能够穿过血脑屏障（BBB），而PD患者由于溶酶体内糖原的积累，会出现进行性的中枢神经系统（CNS）损伤。本研究探讨了使用聚焦超声（FUS）暂时打开血脑屏障，以将重组人酸性α-葡萄糖苷酶（rhGAA）通过静脉注射输送到小鼠大脑特定区域的治疗策略。

我们研究了在5个月大的Gaa?/?敲除小鼠中，通过不同剂量的两种临床可用rhGAA ERTs（alglucosidase alfa和avalglucosidase alfa）进行治疗，并在四个双周治疗周期内分别结合和不结合FUS-BBB开放技术，观察GAA的输送情况以及糖原的积累情况。FUS组中的血脑屏障开放目标具体针对双侧纹状体和皮质。在治疗前10分钟通过腹腔注射苯海拉明以防止过敏反应。最后一次治疗24小时后处死小鼠。其中一个半球用于基于过碘酸希夫（PAS）和H&E染色的组织学分析，另一个半球用于生化检测，以测量GAA酶活性和糖原含量。

对比MRI显示，所有接受FUS治疗的小鼠的血脑屏障均发生开放，且不同半球或治疗周期之间的开放程度无显著差异。与未接受FUS的小鼠相比，接受FUS+ERT治疗的小鼠的PAS染色程度显著降低，表明GAA成功穿过血脑屏障并实现了糖原清除。生化分析也支持了这一结果，显示FUS+ERT治疗组的小鼠GAA酶活性增加，糖原含量减少。未来的工作将确定这种有前景的治疗方案是否能够改善糖原积累后的疾病表现，并推动其临床应用。

引言

庞贝病（PD）是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病，其特征是由于GAA基因的致病性变异导致细胞内糖原过度积累。GAA负责产生酸性α-葡萄糖苷酶（GAA），这是一种参与糖原降解的溶酶体水解酶[1,2]。婴儿期发病的庞贝病（IOPD）患者GAA酶完全失活，导致所有组织中糖原逐渐积累。如果不进行治疗，平均死亡年龄小于2岁，通常由心脏和呼吸功能衰竭引起[3]。晚发型发病的庞贝病（LOPD）患者仍保留部分GAA活性，糖原积累速度较慢。大多数LOPD患者会出现运动功能障碍、肌肉无力和进行性呼吸功能衰竭等症状[3][4][5]。

2004年，重组人GAA的治疗被证明可以有效补充患者体内的缺失酶，显著改善了多种症状[6]。此后，多项临床试验表明，系统性给予酶替代疗法（ERTs）可以延缓疾病进展，表现为对呼吸机的依赖性降低[7,8]、运动技能改善[8,9]、认知功能提升和生长加快[9]。这一成功促使美国和欧洲批准了alglucosidase alfa（Lumizyme）和avalglucidase alfa（Nexviazyme）用于庞贝病的治疗。

庞贝病影响全身每个细胞，包括中枢神经系统（CNS）的细胞。随着患者生存期的延长，听力损失、吞咽困难[10]和构音障碍[11]等神经功能障碍变得更加明显。先前已有研究报道庞贝病患者出现认知能力下降，而脑动脉瘤是LOPD患者最常见的死亡原因之一[11]。然而，ERT药物无法穿透血脑屏障（BBB），因此无法有效治疗CNS的病理变化。

为了解决将药物输送到大脑的问题，可以利用聚焦超声（FUS）与循环中的微气泡结合，暂时破坏血脑屏障，使非渗透性的治疗药物能够进入大脑[12]。集中的声能通过完整的颅骨传递到大脑的一个焦点。快速振荡的压力波使循环中的微气泡收缩和膨胀，对血管壁施加机械力，破坏血管内皮细胞之间的紧密连接。血脑屏障的通透性增强可持续约24小时，从而允许通常无法渗透的药物进入大脑[13]。FUS-BBB破坏技术已在超过30项一期临床试验中用于输送治疗多种神经系统疾病的药物，包括胶质母细胞瘤（例如：NCT03551249）、阿尔茨海默病（例如：NCT05469009）、肌萎缩侧索硬化症（NCT03321487）和帕金森病（例如：NCT05565443）。

在本研究中，我们评估了FUS介导的血脑屏障破坏技术将两种ERT药物alglucosidase alfa和avalglucidase alfa输送到Gaa?/?敲除小鼠庞贝病模型大脑的能力。小鼠组接受了四次双周的系统性ERT治疗，部分组结合了FUS处理。通过过碘酸希夫（PAS）染色的脑切片和GAA酶活性及糖原含量的生化分析，量化了这些治疗对皮质和纹状体中糖原清除的效果。

实验设计

本研究得到了布里格姆妇女医院机构动物护理和使用委员会的批准。本研究使用了61只雄性纯合Gaa?/?敲除（KO）小鼠（JAX品系#004154）和5只野生型对照小鼠，每只小鼠在治疗时的平均体重为32克。仅使用雄性小鼠以最大化统计功效，并基于先前的研究结果，因为雄性小鼠对ERT疗法的反应更显著

血脑屏障开放的MRI量化

使用对比MRI确认并可视化血脑屏障对小分子钆素通透的区域。所有接受FUS处理的小鼠的血脑屏障开放程度如图2所示。图2A显示了静脉注射对比剂前后纹状体和皮质的冠状MRI图像以及相对于对比剂注射前的信号变化百分比。然后测量每个感兴趣区域（ROI）的平均信号变化百分比，以量化血脑屏障的开放程度

讨论

虽然每周两次的静脉注射rhGAA酶替代疗法有效治疗了庞贝病患者的肌肉病理，但未能解决CNS的症状。本研究的总体假设是，FUS-BBB开放技术可以使通常无法穿透血脑屏障的ERT药物通过静脉注射进入大脑，补充Gaa?/?敲除小鼠模型中缺失的酶活性，从而实现四次治疗疗程的效果

作者贡献声明

Paige Nowlin：研究设计、数据分析、数据整理、撰写及审稿编辑。Yongzhi Zhang：研究。Amanda Chrisholm：研究。Haoyue Zhang：研究。Jian Dai：研究。Bernie Simone Owusu-Yaw：数据分析、撰写及审稿编辑。Sarah P. Young：方法学设计、研究、撰写及审稿编辑。Deeksha Bali：研究、数据分析、撰写及审稿编辑。Jaymin Upadhyay：资金筹措

利益冲突声明

作者接受了赛诺菲公司的研究资助。

致谢

这项由研究者发起的研究得到了赛诺菲公司的资助。

作者感谢波士顿哈佛医学院的神经生物学成像设施（NIF）提供的成像服务及所有的免疫组化染色工作。