气道免疫细胞的激活状态是严重哮喘的一个决定性特征，无论是否存在真菌致敏情况

《Mucosal Immunology》：Activation status of airway immune cells is a defining feature of severe asthma, regardless of fungal sensitisation

本研究通过分析严重哮喘患者（SAFS和ABPA）与轻度哮喘及健康对照的免疫细胞特征和分泌因子，发现CD4+ T细胞、树突状细胞亚群（cDC2）和嗜酸性粒细胞升高，并鉴定了IFNγ、IL-9和eotaxin等促炎因子作为疾病严重性的生物标志物。

　　这项研究探讨了严重哮喘与真菌敏感（SAFS）和过敏性支气管肺曲霉病（ABPA）患者的免疫细胞类型及其对气道炎症的影响。随着全球哮喘发病率的上升，尤其是严重的哮喘病例，了解其背后的免疫机制变得尤为重要。研究团队通过收集健康对照组、轻度哮喘患者、重度哮喘患者、SAFS患者和ABPA患者的痰液和外周血样本，利用流式细胞术对免疫细胞进行表型分析，并结合机器学习方法，识别出与严重呼吸道疾病密切相关的免疫细胞特征。

### 研究背景与意义

哮喘是一种常见的慢性呼吸道疾病，影响着全球数亿人。尽管大多数哮喘患者可以通过吸入性治疗控制症状，但约有10%的患者需要高剂量吸入性糖皮质激素（ICS）和第二种控制药物来防止病情恶化。即使如此，这些患者的哮喘仍可能难以控制。因此，理解不同哮喘亚型的免疫机制对于开发更有效的诊断和治疗方法至关重要。

真菌，如曲霉菌（Aspergillus fumigatus）、交替枝孢霉（Alternaria alternata）和黑曲霉（Cladosporium herbarum），已被证实是哮喘和其他呼吸道疾病的重要诱因和加重因素。大约30%至50%的严重哮喘患者对真菌敏感，这种敏感性与较差的治疗反应、肺功能下降、住院率增加以及哮喘相关死亡密切相关。然而，SAFS和ABPA的诊断和治疗仍然存在挑战，特别是在发展中国家，这些患者可能被误诊为反复感染并接受不恰当的治疗。

### 研究方法与数据收集

研究团队招募了100名参与者，包括20名健康对照组（HC）、20名轻度哮喘患者（MA）、20名重度哮喘患者（SA）、20名SAFS患者和20名ABPA患者。所有参与者均提供了痰液和外周血样本，并记录了人口学信息和临床数据。通过流式细胞术，研究团队对这些样本中的免疫细胞进行了详细的表型分析，并利用机器学习方法对数据进行了处理和分析。

在样本处理方面，痰液样本通过离心分离细胞和上清液，并在-150°C下冷冻保存。细胞在冷冻前被重新悬浮在特定的冷冻介质中，以确保细胞活性。血液样本则在EDTA抗凝管中采集，并在室温下运输至实验室。红细胞被裂解后，细胞同样被冷冻保存。所有样本均使用标准的冷冻容器进行控制冷冻。

流式细胞术使用了26个参数的检测面板，以识别包括粒细胞、髓系细胞和T细胞在内的多种免疫细胞类型。此外，还对细胞的表面标志物和激活状态进行了分析，以评估其功能特性。通过机器学习算法，特别是随机森林（Random Forest, RF）模型，研究团队能够从大量的数据中提取出关键的免疫参数，并用于分类和预测疾病状态。

### 研究结果

研究结果表明，外周血中的T细胞频率和激活状态是区分非严重和严重哮喘患者的关键因素。具体而言，CD4+ T细胞的激活状态，以及γδ T细胞和CD8+CD28+ T细胞的频率，在严重哮喘患者中显著升高。这些发现支持了之前的研究，表明T细胞在哮喘的免疫反应中扮演重要角色。

在痰液样本中，除了T细胞外，树突状细胞（DC）亚型（特别是cDC2s）和嗜酸性粒细胞的频率和激活状态也对严重哮喘的识别具有重要意义。此外，IFNγ、IL-9和eotaxin等细胞因子的浓度被发现与疾病严重程度密切相关。这些细胞因子在严重哮喘患者的痰液中显著升高，可能参与了炎症反应的调控。

值得注意的是，尽管SA、SAFS和ABPA患者在某些方面存在相似的免疫特征，但它们之间的差异并不显著。这表明，目前的诊断标准可能不足以区分这些不同的亚型，未来可能需要更精确的技术手段，如单细胞RNA测序或体外细胞刺激实验，来进一步揭示这些亚型的机制差异。

### 讨论与未来方向

研究团队指出，痰液样本在识别严重哮喘患者方面比血液样本更具优势，这可能是因为痰液更直接地反映了气道内的免疫环境。然而，目前的免疫表型分析并未显著区分SA、SAFS和ABPA患者，这提示我们需要更深入的研究来探索这些亚型之间的具体差异。

此外，研究团队强调了T细胞、cDC2s和嗜酸性粒细胞在严重哮喘中的关键作用。这些细胞可能在驱动炎症反应和维持疾病状态中发挥重要作用。因此，未来的研究应进一步探讨这些细胞的功能机制，以及它们在SAFS和ABPA中的具体作用。

在临床应用方面，研究团队认为IFNγ、IL-9和eotaxin等细胞因子可以作为诊断工具，用于区分不同类型的哮喘，并可能帮助将患者分为不同的亚型，如T2高（T2H）和T2低（T2L）。这些细胞因子的检测可以为个性化治疗提供依据，帮助医生选择更适合的治疗方案。

研究团队还指出，由于样本采集和处理的复杂性，目前的研究可能无法完全反映哮喘患者的免疫状态。因此，未来的研究需要在样本采集前进行更详细的评估，以确保数据的准确性和代表性。同时，随着新型生物制剂的不断出现，这些药物对免疫环境的影响也需要进一步研究，以评估其在治疗严重哮喘中的潜力。

### 方法与技术细节

在实验方法上，研究团队采用了多种技术手段，包括流式细胞术、Luminex和ELISA检测，以及统计分析和机器学习模型。流式细胞术用于检测免疫细胞的频率和激活状态，而Luminex和ELISA则用于定量分析痰液中的细胞因子浓度。统计分析采用Prism v9和R软件进行，而机器学习分析则通过随机森林模型实现，以评估不同参数的重要性。

研究团队还提到，由于样本质量的差异，某些免疫细胞类型在分析中被排除。此外，样本中缺失的数据点通过RF模型进行填补，以确保分析的完整性和准确性。这些方法的综合应用，使得研究团队能够从复杂的免疫数据中提取出有价值的信息，并用于疾病的分类和预测。

### 结论

这项研究揭示了严重哮喘患者，特别是SAFS和ABPA患者，其气道免疫环境中的关键细胞类型和细胞因子。通过机器学习分析，研究团队发现CD4+ T细胞、cDC2s和嗜酸性粒细胞在疾病严重程度的识别中具有重要作用。此外，IFNγ、IL-9和eotaxin等细胞因子的浓度也被证明是疾病严重程度的可靠指标。

研究团队认为，这些发现为未来开发更精确的诊断工具和治疗策略提供了新的思路。通过更深入地研究这些免疫细胞和细胞因子的功能机制，可以进一步优化哮喘的管理方案，提高治疗效果。同时，研究也强调了痰液样本在研究气道免疫环境中的重要性，为后续研究提供了方法上的参考。