高通量筛选发现具有新颖作用机制的非核苷类SARS-CoV-2聚合酶抑制剂

《SLAS Discovery》：High-Throughput Screening Identifies Non-nucleoside Inhibitors of the SARS-CoV-2 Polymerase with Novel Mechanisms

非核苷类抑制剂开发为冠状病毒泛抗病毒药物提供新方向，基于PicoGreen检测试剂盒筛选出2个靶向nsp12-nsp8复合物的候选化合物，通过热转移实验和亲和选择质谱验证其非竞争性抑制机制，并建立结构活性关系。

　　冠状病毒的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）是病毒生命周期中的关键组成部分，它由高度保守的非结构蛋白构成，被认为是开发广谱抗冠状病毒药物的极具潜力的目标。尽管已有大量努力通过药物再利用和新化合物发现计划来寻找RdRp抑制剂，但能够有效抑制病毒复制的非核苷类化合物仍然难以找到。在本研究中，我们详细描述了开发一种稳健的PicoGreen检测方法的过程，这种方法使我们能够在AbbVie的化学库中筛选出超过90万种小分子化合物，以评估其对SARS-CoV-2 RdRp的抑制效果。通过结合生化和生物物理检测方法，我们识别出两种具有针对β冠状病毒面板活性的强效非核苷类化合物。机制研究揭示了这些化合物专门结合于nsp12-8复合体中的一个口袋，表明它们可能通过一种独特的非核苷类机制发挥作用。这些化合物为结构-活性关系（SAR）研究和潜在治疗药物的开发提供了有价值的起点。

随着全球对冠状病毒的持续关注，特别是SARS-CoV-2引发的新冠疫情，开发有效的抗病毒药物成为公共卫生领域的首要任务。世界卫生组织（WHO）在2020年3月11日宣布SARS-CoV-2引发的疾病为全球大流行，这是21世纪第三次由冠状病毒引起的全球大流行。尽管SARS-CoV-2的致死率低于之前的冠状病毒大流行，如SARS-CoV和MERS-CoV，但由于其高度传染性，SARS-CoV-2已成为迄今为止造成最多死亡的冠状病毒。因此，识别针对未来可能出现的SARS-CoV-2变种及其他冠状病毒的广谱抗病毒药物具有重要意义。

RdRp作为病毒复制的关键酶，其在病毒生命周期中的作用至关重要。它不仅负责病毒基因组的复制，还在病毒RNA合成过程中起着核心作用。由于RdRp在人类冠状病毒中高度保守，并且在人类中没有同源蛋白，这使得其成为抗病毒药物开发的理想靶点。SARS-CoV-2的RdRp由三个非结构蛋白（nsp）组成，其中nsp12是催化亚基，与一个nsp7和两个nsp8辅因子结合，形成最小的复制-转录复合体。这种结构的特殊性为开发特异性抑制剂提供了可能。

在应对新冠疫情的初期，研究人员主要依赖药物再利用策略来寻找针对RdRp的抑制剂。例如，一种名为suramin的百年老药被发现具有对RdRp的抑制活性，其IC50值为0.26 μM，并且有结构证据表明其与靶标结合。然而，suramin是一种大分子、高电荷的化合物，容易产生非特异性蛋白结合，这限制了其作为治疗药物的潜力。随后，一种名为HeE1-2Tyr的化合物被发现通过冷冻电镜技术作为RNA位移剂，具有抑制登革热病毒聚合酶的活性。尽管HeE1-2Tyr可能是目前报道的最具前景的非核苷类抑制剂之一，但其生化活性（4.9 μM）表明它更适合作为化学起点，而非直接用于临床治疗。

尽管虚拟配体筛选等方法已经识别出许多潜在的非核苷类抑制剂，但由于从计算机模拟到实验数据的转化效率低下，这些化合物大多未能进一步发展。因此，我们决定启动一项高通量筛选（HTS）项目，以识别新的化学物质，这些物质能够有效抑制SARS-CoV-2 RdRp。在这一过程中，我们开发并优化了多种检测方法，其中PicoGreen检测方法被广泛用于评估化合物对RdRp的抑制效果。PicoGreen染料能够区分单链RNA（ssRNA）和双链RNA（dsRNA），从而提供关于RNA合成活性的可靠数据。然而，PicoGreen和类似的dsRNA结合荧光探针在某些情况下可能产生假阳性信号，因此我们通过结合多种生化和生物物理检测方法，建立了一个筛选流程，以过滤这些假阳性结果。

在筛选过程中，我们使用了AbbVie的化学库，该库包含超过90万种小分子化合物。通过初步筛选，我们发现了940种化合物能够抑制核苷酸聚合，其中超过50%的抑制效果被选为进一步研究的候选。为了确保筛选结果的可靠性，我们实施了严格的化学筛选流程，排除了具有高IC50值（>10 μM）、低LCMS纯度（<70%）、不良理化性质、在之前的HTS中表现出广泛活性（promiscuity）以及已知的PAINS（Pan Assay Interference Compounds）结构的化合物，最终筛选出253种化合物进行确认。随后，通过粉末样本的确认，我们确定了其中的48种化合物具有活性，并进一步通过亲和选择质谱（ASMS）分析这些化合物是否与RdRp复合体结合，而不仅仅是与非特异性蛋白相互作用。

最终，两种化合物（Compound 1和Compound 2）被确认为具有靶向RdRp活性的强效非核苷类抑制剂。通过进一步的机制研究，我们发现这些化合物结合于nsp12和nsp8复合体形成的特定口袋，而不是与核苷酸结合。这一发现表明，它们可能通过一种不同于传统核苷类抑制剂的机制发挥作用，即非竞争性结合。这种机制在生化实验中得到了验证，通过热位移分析（TSA）和ASMS检测，我们观察到Compound 2在nsp12和nsp8共同存在时表现出显著的热位移，而在单独存在时则没有这种效应，进一步支持了其结合特异性。

尽管Compound 1和Compound 2在生化实验中表现出良好的抑制活性，但在细胞实验中却未能显示出显著的活性，这可能是由于其在细胞中的弱效力或较差的稳定性与渗透性。然而，通过进一步的化学优化，我们发现这两个化合物在生化和细胞实验中均具有可追踪的SAR，表明它们具有进一步开发的潜力。未来的研究将致力于揭示这些化合物的具体作用机制，并优化其药理特性，以期开发出适用于人类的抗病毒药物。

在本研究中，我们不仅验证了PicoGreen检测方法的有效性，还展示了其在高通量筛选中的应用。通过优化缓冲液成分、底物浓度、辅因子比例以及酶的使用量，我们确保了检测的准确性和可重复性。此外，我们还测试了不同浓度的suramin，以验证该检测方法的适用性。结果表明，suramin在SARS-CoV-2 PicoGreen检测中的IC50值为0.83 μM，与之前报道的0.26 μM相近，进一步证明了该方法的可靠性。

在实际筛选过程中，我们发现使用较低的酶浓度（如5 nM nsp12）能够提高信号与背景的比值，从而增强检测的灵敏度。此外，通过调整缓冲液中的BSA、DTT和Triton X-100等成分，我们有效减少了非特异性抑制效应，提高了筛选结果的准确性。这些优化措施不仅适用于SARS-CoV-2 RdRp的检测，还适用于其他β冠状病毒，如SARS-CoV和MERS-CoV，以评估这些化合物的广谱抗病毒潜力。

通过进一步的生化和生物物理实验，我们确定了Compound 1和Compound 2的结合特性。它们不与UTP或poly(A)竞争，而是结合于nsp12和nsp8形成的特定口袋中。这一发现为开发新型抗病毒药物提供了新的思路，因为这些化合物可能通过不同的作用机制发挥作用，从而减少病毒对传统药物产生耐药性的可能性。此外，由于它们对RdRp的结合具有特异性，这些化合物可能在未来的冠状病毒大流行中发挥重要作用，尤其是针对那些与SARS-CoV-2 RdRp具有较低序列同源性的病毒变种。

总之，本研究通过开发一种稳健的PicoGreen检测方法，成功筛选出两种具有潜在抗病毒活性的非核苷类化合物。这些化合物不仅在生化实验中表现出强效的抑制作用，而且在结构和结合机制上具有独特性，这为未来开发广谱抗冠状病毒药物提供了新的方向。尽管在细胞实验中这些化合物的活性有限，但通过进一步的化学优化，它们有望成为有效的治疗药物。本研究的成果不仅为应对当前的新冠疫情提供了科学支持，也为未来可能出现的冠状病毒大流行做好了准备。