Dz-SiG CRISPR：一种基于DNA酶切换的G-四链结构锁定机制的CRISPR系统，可实现铅离子的等温快速检测

《Talanta》：Dz-SiG CRISPR: A DNAzyme-Switched G-quadruplex-lock CRISPR system for isothermal and rapid detection of lead ions

铅离子检测新策略：基于CRISPR/Cas12a与DNAzyme的G-四联体锁定系统，实现fM级超灵敏检测，30分钟完成现场快速分析，模块化设计支持多小分子检测扩展，适用于复杂环境样本的高效监测。

　　铅（Pb2?）是一种对人体健康和生态系统具有严重危害的重金属。其广泛应用于电池制造、油漆生产以及冶金等领域，但同时也因其毒性而备受关注。长期接触甚至在极低浓度下暴露于铅离子，都会引发不可逆的神经毒性、造血功能障碍以及心血管系统紊乱。此外，工业排放、历史遗留的含铅农药使用以及城市废弃物管理不当等因素，使得铅离子广泛分布在土壤、水体和大气颗粒中，其持久性和生物累积性进一步加剧了生态风险。因此，建立一种快速、超高灵敏度、选择性良好且稳健的分析平台，对于在复杂环境样本中准确检测铅离子，从而实现严格的监测和基于证据的防控措施，具有重要意义。

传统的铅离子检测方法包括原子吸收光谱法（AAS）、原子荧光光谱法（AFS）以及电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）。这些方法在环境监测和食品安全领域得到了广泛应用。然而，这些设备通常体积较大，不具备便携性，限制了其在现场和实时监测场景中的应用，尤其是在应急或野外环境中。为了提高现场检测的可行性，研究人员已经广泛探索了电化学策略。例如，经典的阳极溶出伏安法（ASV）通过在电极表面富集金属离子，再通过溶出伏安法进行检测，从而实现了便携式检测。尽管ASV能够快速分析，但其响应机制依赖于固液界面过程，容易受到电极污染、共存金属离子的重叠溶出峰以及显著的基质效应的影响，导致在复杂环境样本中选择性和重复性受到限制。

近年来，基于催化发夹组装（CHA）或CRISPR/Cas12a系统的电化学传感器被引入，通过在电极上实现信号放大，将检测限降至亚纳摩尔甚至皮摩尔级别。然而，这些平台通常需要多步骤的电极修饰、精确的电位控制以及较长的孵育时间，限制了其在实际应用中的灵活性。相比之下，基于荧光的检测方法提供了一种均相、溶液相的检测模式，所有识别和信号放大过程都在溶液中进行，无需电极。这种“混合与孵育”的工作流程大大简化了操作，减少了对电极污染或界面不稳定性的依赖，并通过光学信号而非法拉第信号提供了较强的抗干扰能力。此外，紧凑的光源和光检测器使得荧光信号的读取可以方便地集成到微型化和便携式设备中，为现场检测提供了新的可能性。

为了实现更简单和快速的检测，DNAzymes（脱氧核酶）被广泛用于高特异性识别元件。DNAzymes具有易于合成、成本低、高特异性以及良好的可编程性等优势，因此基于DNAzymes的生物传感器已成为金属离子检测的重要平台。然而，直接使用DNAzymes检测铅离子往往在实际应用场景中灵敏度不足。为了解决这一问题，研究人员开发了多种信号放大策略，主要依赖于聚合酶或外切酶介导的反应，或利用核酸自组装技术，以增强在复杂环境基质中的检测灵敏度和性能。尽管取得了显著进展，许多现有方法仍然面临高背景信号或复杂操作流程等挑战，限制了其在实际应用中的推广。

近年来，CRISPR/Cas系统因其高特异性和可编程性，在生物传感领域展现出巨大潜力。特别是Cas12a在激活后表现出强大的跨切割活性，能够非特异性地切割单链DNA报告探针，使其成为信号放大的理想候选。然而，直接将Cas12a应用于小分子检测，如铅离子，需要创新的信号传导策略，以实现分子识别与核酸酶激活之间的接口。已有研究探索了将DNAzymes与CRISPR-Cas12a系统相结合的方法。例如，Chen等人通过将铅离子依赖的DNAzyme与CRISPR系统结合，开发了一种可视化检测方法；Xu等人则报告了一种结合二氧化锰纳米材料和Cas12a的比色法，无需预放大步骤。然而，在大多数现有的DNAzyme-Cas12a混合系统中，检测机制依赖于一种设计，即DNAzyme将作为crRNA激活剂的底物链进行封闭。当铅离子诱导切割时，底物被释放并激活Cas12a。然而，这种方法往往由于底物与失活DNAzyme之间的碱基配对动态不稳定性而产生高背景信号，导致Cas12a的抑制不完全和提前激活。

为了解决这一问题，我们提出了一种新的策略，颠覆了传统的设计逻辑。我们不再依赖DNAzyme介导的激活剂释放，而是通过结构抑制直接调控Cas12a的活性。具体而言，我们将RNA G-quadruplex（RG4，一种富含鸟嘌呤的序列，能够折叠成稳定的G-四链体结构）设计在crRNA的5′端，从而建立了一种“信号关闭”状态。当存在铅离子时，一种连接RG4结构与crRNA的底物链会被铅离子特异性的GR-5 DNAzyme切割。这一切割事件释放出功能性的crRNA，使其能够形成活性的Cas12a/crRNA复合物，进而触发对荧光单链DNA报告探针的强烈跨切割，产生显著的“信号开启”响应。该DNAzyme-调控的G-四链体锁定CRISPR（Dz-SiG CRISPR）平台结合了GR-5 DNAzyme对铅离子的高特异性以及通过RG4结构对Cas12a/crRNA系统的精确调控，实现了快速检测（30分钟）、超高灵敏度（检测限为18.91飞摩尔）以及优秀的信噪比，同时显著降低了假阳性信号的发生。该方法在复杂环境样本中表现出良好的回收率，其在水和土壤提取物中的回收率范围为94.44%至99.03%。

为了突出Dz-SiG CRISPR系统在铅离子检测中的优势，我们对几种代表性的先进检测方法进行了系统比较，并总结在表1中。此外，Dz-SiG CRISPR系统的模块化架构使其能够通过简单替换DNAzyme模块，快速重新编程以检测其他小分子目标。其等温且基于荧光的输出特性，在理论上与便携式检测设备兼容，为未来的现场应用提供了可行的路径。综上所述，这些结果确立了Dz-SiG CRISPR作为一种多功能且超高灵敏度的分析工具，用于环境监测和重金属风险评估。