AFB1和DON的共同作用通过下调PI3K-AKT信号通路，诱导猪肠道上皮细胞发生铁死亡（ferroptosis）

《Toxicology》：The combined exposure to AFB1 and DON induces the ferroptosis of porcine intestinal epithelial cells via down-regulating PI3K-AKT signal pathway

黄曲霉毒素B1（AFB1）和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）协同诱导猪肠道上皮细胞（IPEC-J2）ferroptosis，通过抑制PI3K-AKT通路，增加MDA和ROS水平，降低GSH含量，并伴随线粒体损伤及铁代谢紊乱。研究揭示了两种毒素联合暴露的协同毒性机制。

　　Aflatoxin B1 (AFB1) 和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）是两种在饲料中常见且具有高度毒性的霉菌毒素，它们常常共存于发霉的谷物和饲料中，对动物肠道健康构成严重威胁。近年来，随着对霉菌毒素研究的深入，科学家们发现这些毒素不仅影响动物的生长性能，还可能通过复杂的机制影响细胞的死亡方式。其中，铁死亡（ferroptosis）作为一种新型的调控性细胞死亡形式，因其与铁代谢紊乱、脂质过氧化以及氨基酸代谢异常密切相关而受到广泛关注。铁死亡的发现为理解霉菌毒素的毒性机制提供了新的视角，同时也为开发针对性的干预策略奠定了基础。

本研究采用猪肠道上皮细胞（IPEC-J2）作为体外模型，探索 AFB1 和 DON 单独或联合暴露下引发的铁死亡机制。通过一系列实验手段，包括细胞活力检测、氧化应激指标分析、铁代谢相关蛋白表达检测以及透射电镜观察，研究人员发现 AFB1 和 DON 都显著降低了 IPEC-J2 细胞的存活率。在单次暴露和联合暴露的情况下，两种毒素均导致细胞内丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）水平上升，同时降低了谷胱甘肽（GSH）的含量。此外，它们还增加了细胞内的二价铁（Fe2?）含量，并伴随着铁死亡相关蛋白如 GPX4、SLC7A11 和 FTH1 的表达水平显著下降，而转铁蛋白受体 1（TFR1）的表达水平则明显上升。透射电镜观察进一步确认了线粒体在暴露后受到严重损伤，表现为线粒体体积缩小、嵴结构分离和空泡化等特征。

从机制上看，AFB1 和 DON 单独或联合暴露均显著下调了细胞内 PI3K 和 AKT 的磷酸化水平。值得注意的是，使用 PI3K 激活剂 740Y-P 能够显著逆转上述变化，表明 PI3K-AKT 信号通路在铁死亡的调控中发挥着重要作用。此外，相关性分析和分子对接实验也确认了 PI3K/AKT 信号与铁死亡之间存在显著的正相关关系。这一发现进一步支持了铁死亡可能作为 AFB1 和 DON 毒性作用的一种重要机制。

PI3K-AKT 信号通路是细胞内一个经典的信号传导路径，其在调控细胞存活、增殖、氧化应激和代谢平衡方面具有关键作用。PI3K 通过催化磷脂酰肌醇的转化，生成第二信使（如 PIP2 和 PIP3），从而激活下游的 AKT，再通过一系列级联反应调控多种生物学过程。已有研究表明，PI3K-AKT 通路可能参与了 AFB1 和 DON 的毒性机制，但目前尚不清楚该通路是否在这些毒素诱导的肠道上皮细胞铁死亡中起中介作用。因此，本研究选择 IPEC-J2 细胞作为体外模型，系统地探讨 AFB1 和 DON 单独或联合暴露下对铁死亡的影响，旨在为更深入地理解霉菌毒素的肠道毒性机制以及开发针对性的预防和控制策略提供理论依据。

在实验设计方面，研究人员首先通过 CCK-8 实验检测了 AFB1 和 DON 对 IPEC-J2 细胞存活率的影响。结果显示，随着 AFB1 和 DON 浓度的增加，细胞存活率呈现出浓度依赖性下降的趋势。为了进一步研究这两种毒素的联合毒性效应，实验采用了关键毒性浓度的策略，即使用一种毒素的浓度，该浓度足以引起细胞轻微但可检测的存活率下降。通过这种方法，研究人员能够更准确地评估 AFB1 和 DON 在不同浓度组合下的毒性作用，并进一步分析其可能的协同效应。

除了细胞活力的检测，研究还对细胞内的氧化应激指标进行了评估。结果显示，AFB1 和 DON 单独或联合暴露均显著增加了细胞内的 MDA 和 ROS 水平，同时降低了 GSH 的含量。这些变化表明，毒素暴露可能通过破坏细胞内的抗氧化系统，导致氧化应激的加剧，从而对细胞造成进一步的损伤。此外，研究还发现这两种毒素暴露后显著增加了细胞内的 Fe2? 含量，并伴随着铁死亡相关蛋白如 GPX4、SLC7A11 和 FTH1 的表达水平下降，而 TFR1 的表达水平则显著上升。这些结果表明，毒素可能通过干扰铁代谢平衡，促进铁死亡的发生。

透射电镜观察进一步揭示了毒素暴露对线粒体的破坏作用。结果显示，AFB1 和 DON 暴露后，线粒体的结构发生了显著变化，表现为体积缩小、嵴结构分离和空泡化等现象。这些变化与铁死亡的典型特征相符，说明线粒体损伤可能是铁死亡发生的重要表现之一。此外，研究人员还对 PI3K-AKT 信号通路的活性进行了分析，发现毒素暴露显著下调了 p-PI3K 和 p-AKT 的蛋白水平。而使用 PI3K 激活剂 740Y-P 则能够逆转这些变化，表明 PI3K-AKT 信号通路在铁死亡的调控中具有关键作用。

进一步的机制研究还表明，AFB1 和 DON 暴露可能通过抑制 PI3K-AKT 信号通路，导致细胞内铁代谢紊乱，进而引发脂质过氧化和铁死亡。PI3K-AKT 通路的抑制可能通过影响细胞内的铁摄取和代谢平衡，导致 Fe2? 的积累，从而促进铁死亡的发生。同时，PI3K-AKT 通路的抑制还可能通过影响抗氧化系统的活性，导致 GSH 水平下降和 ROS 水平上升，进一步加剧细胞损伤。

研究还发现，AFB1 和 DON 的联合暴露相较于单独暴露，对 IPEC-J2 细胞的毒性作用更为显著。这种协同效应可能与两种毒素对细胞内多个通路的干扰有关。例如，AFB1 和 DON 可能共同作用于 PI3K-AKT 信号通路，导致其活性进一步下降，从而增强铁死亡的发生。此外，两种毒素可能共同作用于铁代谢相关蛋白，如 TFR1、GPX4 和 SLC7A11，导致其表达水平的变化更加显著，从而加剧细胞损伤。

在实际应用中，了解 AFB1 和 DON 的毒性机制对于制定有效的饲料安全策略至关重要。目前，许多研究已经关注了这些毒素对动物健康的影响，但大多数研究仅集中在单一毒素的毒性效应，忽略了实际环境中常见的“联合暴露”现象。因此，本研究通过体外实验模型，系统地探讨了 AFB1 和 DON 在联合暴露下的毒性机制，为全面评估霉菌毒素的综合风险提供了新的依据。

此外，本研究的结果还表明，铁死亡可能作为 AFB1 和 DON 毒性作用的一种重要机制。铁死亡的发现为理解霉菌毒素的毒性机制提供了新的视角，同时也为开发针对性的干预策略奠定了基础。例如，通过调节 PI3K-AKT 信号通路的活性，可能有助于减轻毒素暴露引起的铁死亡，从而保护肠道上皮细胞的完整性。因此，未来的研究可以进一步探讨 PI3K-AKT 信号通路在铁死亡调控中的具体作用，以及如何通过干预该通路来减轻霉菌毒素的毒性效应。

综上所述，本研究通过 IPEC-J2 细胞模型，系统地探讨了 AFB1 和 DON 单独或联合暴露下对铁死亡的影响。结果显示，这两种毒素均能显著降低细胞活力，并通过多种机制诱导铁死亡的发生。其中，PI3K-AKT 信号通路的抑制可能是铁死亡发生的关键因素。研究还发现，AFB1 和 DON 的联合暴露相较于单独暴露，对细胞的毒性作用更为显著，可能与它们对多个细胞通路的协同干扰有关。这些发现不仅加深了对霉菌毒素毒性机制的理解，也为开发针对性的饲料安全策略提供了新的思路。未来的研究可以进一步探讨 PI3K-AKT 信号通路在铁死亡调控中的具体作用，以及如何通过调节该通路来减轻霉菌毒素的毒性效应。