《Toxicology and Applied Pharmacology》：Matrine triggers cardiotoxicity via apoptosis induced by reduction of GSH synthesis through the ATF4/CTH pathway
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马兜铃碱（MT）通过抑制ATF4/CTH通路导致谷胱甘肽（GSH）不足，引发线粒体功能障碍和凋亡，而抑制caspase-3或补充GSH可缓解毒性，过表达ATF4或CTH可逆转MT的心脏毒性。
Xin Zheng|Wei Wu|Yurou Li|Wupei Pan|Yinan Xu|Lianwei Zhong|Yinjie Jiang|Jie Zhou
宜昌大学基础医学院，中国湖北省宜昌市元州区学府路576号，邮编336000
摘要
马兜铃碱（MT）是从Sophora flavescens中提取的一种生物碱，在传统中医中广泛应用。然而，其临床应用受到毒性的限制。本研究探讨了激活转录因子4 /半胱氨酸γ-裂解酶（ATF4/CTH）通路在MT诱导的心脏损伤中的作用。结果表明，MT显著降低了半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH）的水平，导致线粒体功能障碍和细胞凋亡，其特征是活性氧（ROS）积累、mPTP开放、ΔΨm破坏以及caspase-9/3的激活。然而，抑制caspase-3和补充GSH可以缓解这些毒性作用。NAC通过为GSH合成提供Cys来类似地保护细胞免受MT诱导的凋亡，而BSO通过抑制GSH生物合成消除了这种保护作用。此外，MT还抑制了ATF4的表达及其转录活性，导致下游靶基因CTH的mRNA和蛋白质水平降低，从而减少了CTH依赖的Cys生成。过表达ATF4或CTH可以恢复细胞内Cys和GSH的水平，从而减轻MT诱导的凋亡。CTH敲低完全消除了ATF4过表达的保护作用，而CTH过表达即使在缺乏ATF4的情况下仍能保持其保护效果。这些结果表明，MT诱导的ATF4/CTH通路抑制导致GSH缺乏，进而引发线粒体依赖的凋亡和心脏毒性。
引言
马兜铃碱（MT）是一种从传统中药苦参（Sophora flavescens Aiton）中提取的喹诺利嗪生物碱（Wang et al., 2025），因其多种药理特性而在临床实践中得到广泛应用，如抗炎（Mao et al., 2024）、抗病毒（Qiao et al., 2024）和抗肿瘤活性（Zhao et al., 2024）。然而，越来越多的证据表明MT会对肾脏（Wang et al., 2024a）、肝脏（Tao et al., 2025）、心脏（Wang et al., 2019）和其他器官（You et al., 2020）产生毒性作用。一项体内研究表明，MT会导致斑马鱼心率下降和畸形率增加（Fang et al., 2024）。体外实验进一步发现，MT在AC16心肌细胞中的细胞毒性与两种失调的RNA修饰m6A和A-to-I密切相关（Fang et al., 2024）。此外，MT剂量依赖性地改变了hiPSC-CM的阻抗和细胞外场电位，并伴有LDH、cTnI和CK-MB水平的升高。MT还会破坏钙平衡和氧化应激（Wang et al., 2019）。在之前的研究中，我们发现MT在H9c2细胞中诱导ROS积累和铁死亡（ferroptosis），仅部分受到铁死亡抑制剂Fer-1的保护（Wang et al., 2024b）。这些发现表明，MT引发的心脏毒性的分子机制很复杂，可能涉及其他形式的细胞死亡。
暴露于有毒外源性物质的细胞会产生过量的ROS。当ROS积累超过内源性抗氧化系统（如超氧化物歧化酶SOD、GSH和过氧化氢酶CAT）的清除能力时，就会引发氧化应激，导致生物大分子损伤，并进一步诱导多种细胞死亡方式，如铁死亡、凋亡、自噬和坏死（Zeng et al., 2024）。凋亡已被证实与多种药物的心脏毒性作用有关，例如三萜醇（Wu et al., 2023）、异鼠李素（Guo et al., 2025）和麻黄碱（Nyska et al., 2005）。MT还通过氧化应激和激活凋亡导致肾毒性和肝毒性（Wang et al., 2023；You et al., 2019）。然而，MT引发的心脏毒性中凋亡的作用尚未被报道。
ATF4是一种应激诱导的转录因子，参与调节多种病理生理过程，包括凋亡、代谢、抗氧化防御和肿瘤发生（Li et al., 2023）。值得注意的是，ATF4在凋亡中的作用似乎取决于具体情境（Zhang et al., 2025a；Zhang et al., 2025b）。ATF4作为促凋亡因子，参与药物诱导的炎症、氧化应激和器官损伤。相反，ATF4过表达通过缓解GSH耗竭、ROS积累和凋亡而发挥保护作用（Le et al., 2025）。作为关键的细胞内抗氧化剂，GSH在维持细胞氧化还原平衡中起着关键作用。GSH可以直接清除ROS（Li et al., 2025），并阻断氧化应激诱导的线粒体通透性转换孔（mPTP）开放，从而抑制凋亡级联反应的激活（Kobayashi et al., 2022）。GSH的生物合成严重依赖于半胱氨酸的供应，而半胱氨酸主要由CTH通过转硫途径（TSP）生成（Wang et al., 2024a；Akbarian et al., 2022；Badiei et al., 2019）。CTH的表达通过ATF4进行转录调控，ATF4与CTH基因启动子中的顺式/调控元件（CRE）结合，在细胞应激时驱动其表达（Xi et al., 2025）。ATF4的耗竭会抑制CTH表达，导致GSH合成受损和氧化损伤敏感性增加（Dickhout et al., 2012）。这些发现表明ATF4/CTH/GSH轴在氧化还原调节和细胞保护中起着重要作用。
因此，本研究旨在探讨氧化应激、凋亡和ATF4/CTH通路在MT诱导的心脏损伤中的作用。我们假设MT抑制ATF4驱动的CTH表达，从而减少细胞内Cys的可用性和GSH的生物合成，破坏氧化还原平衡，最终使心肌细胞对氧化损伤和凋亡敏感。此外，我们评估了通过药理学或遗传学靶向ATF4/CTH/GSH轴是否是一种新的治疗策略，以减轻MT诱导的心脏毒性。
实验材料
化学试剂
MT（M109803）、Ac-DEVD-CHO（Ac-DC, A422092）、还原型GSH（G105427）、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC, A105420）和D,L-丁硫氨酸-(S,R)-磺胺（BSO, D275570）均购自Aladdin（中国）。动物实验
雄性ICR小鼠（6–8周龄，20–22克）在实验前适应实验室环境5天。所有动物实验均按照宜昌大学实验动物管理委员会批准的方案进行（编号2022036）。MT对ICR小鼠的心脏损伤作用
首先，我们研究了MT对小鼠的心脏毒性作用。MT增加了相对心脏重量指数和血清中的LDH、cTnT和CK-MB水平（图1A和B）。此外，H&E染色显示心肌纤维结构紊乱和断裂、心肌和血管充血以及心脏组织出血（图1C）。随后，我们研究了MT是否调节小鼠心脏组织中的凋亡相关生物标志物和蛋白质表达。
讨论
药物引起的心脏损伤是一个主要的健康风险，特别是对于接受全身治疗的患者（Fang et al., 2024）。MT是从S. flavescens中提取的，这种植物在中医中广泛用于治疗多种疾病（You et al., 2019）。尽管其潜在的副作用已被广泛讨论，但其作用机制尚未完全阐明。我们的研究结果表明，MT对H9c2细胞和小鼠心脏组织具有有害作用，这表现为ROS的过度积累。
作者贡献声明
概念化和初稿撰写：Xin Zheng；数据整理：Wei Wu；数据分析：Yurou Li；方法学设计：Wupei Pan和Yinan Xu；实验研究：Lianwei Zhong；验证：Yinjie Jiang；监督、审稿和编辑：Jie Zhou。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（编号82460815）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报道工作的财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢中国宜昌大学的Minjuan Xie在心脏组织处理方面的宝贵帮助，以及中国郑州大学第一附属医院的Chen Xi提供的专业技术支持。
