一种用于超声辅助固定化酶水解以制备牦牛骨胶原肽的新策略：工艺优化、结构特性及抗氧化机制

《Ultrasonics Sonochemistry》：A novel strategy for ultrasound-assisted immobilized enzyme hydrolysis for the preparation of yak bone collagen peptides: Process optimization, structure and antioxidant mechanisms

提取牦牛骨胶原蛋白肽（YCP）的最佳工艺为超声功率415W、水解温度49℃、时间8.4h、酶载量3.6%，水解度达22.36%。该技术显著提升YCP产率、粒径分布（217.45±1.71nm）及抗氧化活性（DPPH/ABTS清除率75.43%），并鉴定出10种新型抗氧化肽，其中P1、P4、P10通过氢键与Keap1蛋白结合（结合能-4.64至-1.36 kcal/mol），有效破坏Keap1-Nrf2信号通路。结构表征显示超声协同固定化酶水解使YCPβ-折叠占比提升，热稳定性提高至74.83℃，为功能性食品开发奠定基础。

　　近年来，随着对天然食品成分研究的深入，食品来源的抗氧化肽因其出色的生物利用度和安全性逐渐受到食品工业的重视。本研究通过一种新型的超声辅助固定酶水解技术（US + IP-EH），从牦牛骨中提取出具有抗氧化活性的胶原蛋白肽（YCP），并对其结构特性、稳定性以及抗氧化机制进行了全面分析。研究结果表明，最佳的提取条件为：超声功率415瓦，酶水解温度49℃，水解时间8.4小时，固定酶用量3.6%，在验证实验中水解度（DH）达到22.36%。值得注意的是，US + IP-EH方法显著提高了YCP的产率、结构完整性和抗氧化能力，使其在高温、极端pH值（强酸或强碱）、光照暴露和胃肠道消化等恶劣条件下仍能保持良好的抗氧化稳定性。此外，研究还成功鉴定了十种新的抗氧化肽，这些肽显示出无致敏性和无毒性等优点。其中，P1、P4和P10这三种肽与Keap1蛋白的主要结合位点形成良好的相互作用，从而有效破坏Keap1-Nrf2复合物的结构，这为牦牛骨胶原蛋白在功能性食品和健康产品中的开发提供了坚实的理论和实践基础。

抗氧化肽在减少活性氧（ROS）积累、保护生物分子和调节细胞信号通路方面表现出色，有助于改善健康。而饮食中的抗氧化物血浆水平与由氧化损伤引起的疾病发生率呈负相关，因此摄入富含抗氧化成分的食品是有效对抗氧化应激的手段之一。目前，天然抗氧化肽因其较高的消化吸收效率和较低的分子量及毒性，被广泛认为是缓解氧化应激的高效成分。胶原蛋白是一种由动物细胞合成的生物大分子，其水解产物胶原蛋白肽具有显著的抗氧化特性，能够清除体内的自由基并降低氧化应激水平。此外，胶原蛋白肽还包含多种生物活性成分，如生长因子，这些成分在延缓皮肤老化、预防动脉粥样硬化和促进骨细胞生长方面发挥重要作用。

中国拥有全球85%的牦牛种群，但牦牛屠宰后，其骨骼（约占体重的20%）的深度加工和高附加值利用仍较为有限，这不仅造成宝贵的骨骼资源浪费，也对高原生态环境构成压力。牦牛骨富含胶原蛋白，因此成为生物活性肽的重要来源。已有大量研究记录了牦牛骨胶原蛋白肽（YCP）的制备方法及其生物活性。这些肽已被证实具有增强骨骼健康、抗衰老和抗糖尿病等有益作用。同时，研究表明YCP能够改变小鼠肠道微生物群的组成，增加短链脂肪酸的生成，还能通过调控NF-κB信号通路和NO的产生来有效减轻炎症反应。因此，YCP在改善人类健康方面展现出广阔的应用前景。

酶水解是生产生物活性肽的常见方法，但整个过程通常耗时较长，且产率相对较低。通过人工技术从生物体中提取酶并将其固定在合适的载体上，可以制备出具有催化活性的固定酶，这些酶在不同温度和pH条件下表现出更强的适应性和耐受性，同时对蛋白酶和抑制剂的抵抗能力也更强，这不仅提高了生产效率，还有效保护了氨基酸免受降解。此外，固定酶方法特别适用于连续和自动化的工业生产过程。然而，目前关于利用固定酶技术制备蛋白肽的研究仍较为有限。近年来，微波、高压脉冲电场和超声等新兴技术被广泛用于辅助酶水解。其中，超声技术因其环保、清洁、高效、安全和易于操作等优点而备受关注。在超声处理过程中，液体中的振动会产生微小气泡，当这些气泡达到临界尺寸时会瞬间破裂，形成强烈的冲击波。气泡破裂时，局部压力会急剧上升，产生强大的剪切力。这一过程伴随着局部高温，最终引发“超声空化”效应。由于其空化效应，超声技术已被证明可以提高生物活性成分的提取效率并缩短处理时间。最近的研究还确认了超声辅助酶水解技术在提升功能成分提取率、蛋白质转化率和酶水解速率方面的潜力。He等的研究发现，超声辅助处理不仅提高了牛皮明胶胶原蛋白肽的提取率和抗氧化活性，还显著改变了胶原蛋白的物理结构，使其微观结构更加松散、多孔且均匀。然而，目前尚无研究探讨超声与固定酶联合处理在牦牛骨胶原蛋白肽生产中的效果。

本研究提出了一种新型的超声辅助固定酶水解方法，用于从牦牛骨中提取胶原蛋白肽。通过响应面法（RSM）优化关键的水解参数，以提高水解效率和肽的抗氧化活性。为了精确分离和鉴定YCP中的肽片段，研究采用了超滤与液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）相结合的方法。同时，分子对接技术被用于模拟胶原蛋白肽与Keap1蛋白的相互作用，以深入评估其生物特性并揭示其潜在的分子机制。这项研究为YCP在未来不同行业和领域的应用和发展奠定了基础。

在材料和方法部分，研究使用了新鲜的牦牛腿骨，并通过骨锯将其切割成1-2厘米的小块。随后，这些骨块在气流干燥箱中干燥，使用粉碎机粉碎后通过60目筛分，并储存在-18℃以备后续使用。所有化学品均为分析级，并从中国医药集团化学试剂公司获得。研究中采用共价结合的方法制备固定木瓜蛋白酶，首先选择富含表面氨基的壳聚糖微球作为载体，将其在25℃下与特定浓度的戊二醛溶液反应2小时，以在载体表面引入醛基。随后，载体被去离子水彻底清洗以去除多余的戊二醛。激活后的载体与一定浓度和活性的木瓜蛋白酶在pH 7.0和4℃下混合，并在慢速搅拌12小时后，使酶分子的氨基与载体上的醛基形成稳定的席夫碱（共价键）。反应完成后，通过过滤收集固定酶，并用磷酸盐缓冲液反复洗涤，直到洗脱液中不再检测到游离蛋白，确保完全去除未结合的酶。最终的固定木瓜蛋白酶在4℃下保存以备后续使用。

在提取和纯化牦牛骨肽的过程中，骨粉与0.5 mol/L 冰乙酸按1:10（w/v）的比例混合，并在4℃下连续搅拌48小时进行酶解。酶解后，通过等电点沉淀法回收胶原蛋白。沉淀物在4℃和10,000转/分钟下离心20分钟，随后冻干。胶原蛋白肽的制备通过超声辅助固定酶水解完成，其中50 mL样品在超声细胞破碎仪（Digital Sonifier 450，Branson，美国）下以20 kHz频率处理30分钟。探头浸入深度为2厘米，脉冲周期为10秒开、5秒关。

在优化牦牛骨肽提取过程的实验中，研究通过单因素实验考察了酶解温度（35, 40, 45, 50, 55, 60℃）、酶解时间（2, 4, 6, 8, 10, 12小时）、超声功率（100, 200, 300, 400, 500, 600瓦）以及固定酶添加量（2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5%）对DH的影响。研究发现，随着温度的升高，DH值显著增加，这可能是由于高温使更多酶切位点暴露，从而加快水解反应并提高蛋白质的DH。然而，当温度从50℃升高到60℃时，DH值下降，这可能是由于碱性胰蛋白酶在高温下失活，导致DH降低。因此，选择了50℃作为后续水解的温度。在酶解时间方面，YCP的DH呈现出双相模式，在8小时超声处理后达到峰值，随后在长时间处理中逐渐下降。这一趋势可能与超声处理过程中气泡的反复坍塌有关，这种坍塌会产生压缩冲击波和升高的热条件。因此，延长处理时间超过8-10小时会导致蛋白质热变性，从而影响酶活性，降低催化效率。在超声功率方面，研究发现超声功率显著影响DH值（P < 0.05），在500瓦时达到最大水解效率（22.03%）。研究表明，较低的功率密度会导致蛋白质溶液温度逐渐升高，同时降低空化阈值，促进空化气泡的形成。然而，超过500瓦时，DH值开始下降，这可能是由于高功率条件下的蛋白质热变性和蒸汽压增加，从而降低空化效率和超声效果。此外，气泡簇可能会屏蔽内部气泡，限制空化强度的进一步提升。在固定酶添加量方面，研究发现，当固定酶浓度为3.5%时，DH值达到最大（16.40%）。DH的增加主要归因于较低浓度的固定酶增强了酶-底物结合。尽管酶的添加量可以推动反应的进行，但过高的浓度可能导致质量传递限制和产物抑制，从而降低产物产率和水解效率。因此，选择3.5%的固定酶浓度进行响应面优化。

通过响应面法优化提取条件，并进行实验验证，研究确定了最佳的处理参数：酶解温度49.22℃，水解时间8.41小时，超声功率415.42瓦，固定酶用量3.62%。预测的DH值为22.37%，实际测试中，经过调整后的优化条件为49℃、8.4小时、415瓦和3.6%的固定酶用量，三次平行测试结果为22.36% ± 0.18%，与模型预测值高度一致。因此，选择超声辅助固定酶水解方法对YCP进行处理，为进一步研究其结构修饰和抗氧化潜力提供了依据。

在结构表征方面，研究利用扫描电子显微镜（SEM）分析了不同处理方法对YCP微观结构的影响。结果表明，超声辅助和固定酶处理显著改变了YCP的形态特征。传统酶解得到的肽段尺寸较大，结构完整且表面平滑，而超声辅助固定酶处理得到的肽段尺寸较小，结构更为紧凑且表面更光滑。超声处理促进了蛋白质构象的降低，表明了超声作用在蛋白质水解中的关键角色。此外，研究通过激光散射传感器测定了YCP的粒径，结果显示，超声辅助固定酶处理显著减小了水解产物的粒径。这种减小可能与超声引起的空化效应有关，该效应通过改变肽的物理性质来减小粒径。观察到的粒径变化表明，超声处理对胶原蛋白肽的结构和功能特性有重要影响。超声产生的剪切力破坏了蛋白质之间的相互作用，如疏水作用和氢键，从而导致粒径减小。此外，研究还通过荧光光谱分析了YCP的结构变化。蛋白质或肽的荧光光谱在构象变化时会发生显著改变。YCP在312 nm和353 nm处表现出荧光发射强度，表明其荧光主要来源于酪氨酸和色氨酸残基。当应用超声处理时，YCP的荧光强度显著降低，这可能与超声引起的蛋白质聚集状态变化及其局部环境的影响有关。先前的研究表明，超声处理会诱导蛋白质分子结构的展开，从而暴露更多活性基团，显著增强其水解效率和抗氧化能力。

通过X射线衍射（XRD）分析，研究探讨了YCP的结晶特性。XRD图谱显示出YCP在2θ=19.82°处具有特征的宽泛晕，表明其无定形特性。然而，US + IP-EH组的特征衍射峰移动至22.68°，并显示出更高的强度。这一现象可能与超声引起的结构重组有关，其中部分无定形区域转化为结晶相，从而提高整体结晶度。先前的研究指出，超声处理能够减少胶原蛋白分子间距，增强分子间相互作用，形成结构有序的结晶区域。

傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析则用于评估YCP的二级结构变化。FTIR光谱显示，YCP具有特征的吸收带，包括酰胺A在3243-3289 cm?1处的振动，酰胺I在1645-1650 cm?1处的吸收，以及酰胺II在1553-1555 cm?1处的吸收。酰胺A带主要与肽链中的N-H伸缩振动和氢键相互作用有关，其特征频率位于3440-3300 cm?1之间。如果酰胺A峰发生偏移，可能会移至3300 cm?1或更低，表明在超声处理后可能形成了新的氢键结构。此外，酰胺I带的吸收主要来自酰胺基团的C-O伸缩振动，而酰胺II带的吸收则主要来自酰胺基团的变形振动、N-H伸缩和C-N伸缩振动。酰胺III振动模式则涉及C-N伸缩和N-H面内弯曲运动的耦合。观察到的光谱偏移揭示了超声处理对肽二级结构的改变。超声处理后，YCP的α-螺旋含量增加，而无规则卷曲结构的含量减少。这些结果表明，超声处理过程中产生的微喷射、湍流、剪切力和冲击波破坏了胶原蛋白亚基之间的连接以及蛋白质分子内部不同区域或成分之间的相互作用。

差示扫描量热法（DSC）用于评估YCP的热稳定性。研究显示，不同处理方法得到的YCP在25℃至70℃范围内表现出稳定的DPPH自由基清除率。当温度进一步升高至100℃时，所有四组的抗氧化能力显著下降（P < 0.05），其中US + IP-EH组的抗氧化活性保持在75%以上，显著高于其他三组。先前的研究表明，参与自由基清除的氨基酸残基通常是疏水性氨基酸，这些残基通常被埋藏在分子核心中。高温会诱导肽的构象变化，使这些疏水性残基暴露在水相中，从而暴露更多活性位点，有助于保持自由基清除能力。

pH值的变化会影响肽的离子化行为和电子转移，进而影响其抗氧化能力。研究通过不同pH条件下的DPPH自由基清除率评估了YCP的pH稳定性。结果显示，在pH低于6或高于8时，所有四组的YCP的DPPH自由基清除率均有所提高，其中US + IP-EH组的提高幅度达到6.05%。这表明，YCP在强酸和强碱条件下仍能保持良好的抗氧化稳定性。此外，酸性条件可能影响肽分子中羟基的可及性，从而增强其供氢能力。在某些pH条件下，抗氧化肽中的氨基酸残基可以达到最佳的离子化状态，从而增强其与自由基的反应能力。

光照条件对YCP的抗氧化活性也有影响。研究表明，长时间暴露在阳光下会导致皮肤不可逆损伤，因此开发天然抗氧化剂以保护皮肤免受光损伤成为重要研究方向。研究通过不同光照条件下的DPPH自由基清除率评估了YCP的光稳定性。结果显示，在黑暗条件下，YCP表现出较强的抗氧化特性，而在自然光或紫外线照射下，其DPPH自由基清除率下降。与其它组相比，US + IP-EH组更好地维持了YCP的抗氧化活性，这表明通过超声辅助固定酶水解得到的YCP具有良好的光稳定性，适合用于防晒化妆品等产品。

营养物质的吸收和利用依赖于胃肠道的消化和吸收过程。因此，有必要评估YCP在模拟胃肠道消化后的抗氧化活性变化。研究显示，经过胃和肠道消化阶段后，所有四组的YCP的DPPH自由基清除能力均有所提高，这与Zhu等的研究结果一致。这种增强可能是由于胃蛋白酶和胰蛋白酶将肽分解为更小的片段，从而暴露更多的疏水性基团，提高肽的抗氧化活性。这些结果表明，YCP在食品工业中具有良好的应用潜力。

通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，研究成功分离并鉴定了YCP中的422个肽段。其中，P1的检测强度最高，达到3.1766×10?。此外，研究还利用SWISS-MODEL对这些肽的构象进行了预测，结果表明这些肽具有良好的生物活性和抗氧化潜力。近年来，生物信息学的发展使得多种计算工具可用于从原始序列数据中预测抗氧化肽，如PeptideRanker、AnOxPePred和ToxinPred。研究表明，这些工具可以有效筛选出具有抗氧化活性的肽。在本研究中，通过这些计算工具，发现有十种具有潜在抗氧化活性的生物活性肽。ToxinPred进一步确认了这些肽的非毒性特征。这些发现表明，这些肽具有良好的加工特性，适合用于食品产品中。

为了进一步探讨YCP的抗氧化机制，研究进行了分子对接分析，将10种候选肽与Keap1/Nrf2复合物进行对接，以识别关键的结合相互作用。结果表明，只有P1、P4和P10能够与Keap1/Nrf2形成稳定的复合物。在这三种抗氧化肽中，P1与Keap1的结合能最低（-4.64 kcal/mol），表明其结合亲和力最强，其次是P10（-3.11 kcal/mol）和P4（-1.36 kcal/mol）。结合能是评估配体与受体之间结合亲和力的定量指标，结合能值越负，表示分子相互作用越强。此外，P1、P4和P10与Keap1中的多个氨基酸残基（如SER555、SER508、ARG483、ARG326、HIS516、VAL514、VAL561、VAL608、ASP422和GLY423）形成氢键，显示出良好的抗氧化潜力。与先前的研究一致，氢键在小分子与蛋白质的相互作用中起主导作用，这得到了本研究数据的支持。

本研究的结论表明，通过超声辅助固定酶水解技术（US + IP-EH）从牦牛骨中提取YCP是一种高效且稳定的方法。单因素实验和响应面法优化后的最佳提取条件为：酶解温度49℃，水解时间8.4小时，超声功率415瓦，固定酶用量3.6%。在这些条件下，YCP的水解度达到22.36%。与传统方法相比，US + IP-EH方法提高了YCP的产率、结构完整性和抗氧化能力，使其在高温、极端pH值、光照和胃肠道消化等条件下仍能保持良好的抗氧化稳定性。研究成功从YCP中分离并鉴定了422个肽段，其中10种新型抗氧化肽被发现，它们显示出良好的稳定性、非致敏性和安全性。这些肽通过占据Keap1的关键结合位点，与Keap1形成有效相互作用，从而破坏Keap1-Nrf2复合物的结构。这些发现确认了YCP作为天然成分在功能性食品中的强大抗氧化活性和应用潜力。为了进一步阐明其抗氧化机制，未来的研究应关注以下两个方面：（1）在细胞水平上探讨YCP对氧化应激相关基因和信号通路（如Nrf2/ARE、NF-κB）的影响；（2）利用氧化损伤动物模型，系统评估YCP对抗氧化生物标志物、组织病理学和体内吸收代谢的影响。这些研究将为YCP的进一步开发和应用提供坚实的理论基础。