通过流体动力空化产生的羟基自由基制备低分子量壳聚糖

《Ultrasonics Sonochemistry》：Preparation of low molecular weight chitosan through hydroxyl radicals generated via hydrodynamic cavitation

水力空化联合过氧化氢降解高聚壳聚糖至低分子量（20-30 kDa），优化压力差（700 kPa）与多孔口（H5）组合，显著提升降解效率，同时保留结晶性和热稳定性，实现环保高效制备低分子量壳聚糖。

　　低分子量壳聚糖因其相较于高分子量壳聚糖更优异的溶解性和生物活性，备受研究者关注。然而，如何在温和且环保的条件下高效地对壳聚糖进行降解，仍是当前面临的重要挑战。本研究中，我们利用孔板收缩所产生的水动力空化效应，并结合过氧化氢（H?O?）作为氧化剂，成功地在常温、短时间的条件下对壳聚糖进行降解，从而获得低分子量产物。我们系统地考察了空化强度、H?O?浓度、样品制备方法以及反应介质pH值等参数对壳聚糖降解效率的影响。在20°C下，经过48分钟的处理（对应800次空化循环），壳聚糖的重均分子量从710 kDa降至20 kDa，且其分子量分布基本保持不变。与单独使用氧化剂或空化处理相比，空化与H?O?结合的降解效果显著更好，分别为390 kDa和510 kDa。降解后的壳聚糖保留了原始壳聚糖的主链结构，而羟基自由基（•OH）对糖苷键的氧化断裂则在链端形成了一些发色团，但由于其浓度低于傅里叶变换红外光谱（FTIR）和核磁共振（NMR）的检测限，因此未能在这些分析中被明显观察到。降解后的壳聚糖在结晶度和热性能方面与原始壳聚糖基本一致，表明其结构稳定性较高。本方法为生产低分子量壳聚糖提供了一种环境友好且可持续的替代方案。

壳聚糖作为一种重要的天然多糖，广泛来源于甲壳类动物外壳、真菌和昆虫外骨骼等。其高结晶度和广泛的氢键网络使其在常规溶剂中难以溶解。因此，通常需要部分或完全脱乙酰化以获得具有氨基功能的壳聚糖。全球壳聚糖产量预计将在2027年达到281万吨，相较于2020年的107万吨。壳聚糖因其抗真菌、抗菌、抗氧化等特性，以及其在伤口愈合、成膜、成纤维等方面的潜力，被广泛应用于医药、食品、农业、海水淡化膜制备和废水处理等多个领域。然而，壳聚糖的使用受到其溶解性差和高分子量导致的高粘度的限制。因此，研究者对低分子量壳聚糖（LMW chitosan）的制备技术产生了浓厚兴趣，因为低分子量壳聚糖不仅具有更好的水溶性，还表现出更高的生物活性。

目前，低分子量壳聚糖的制备方法主要包括化学降解、酶解和物理降解。化学降解方法虽然能有效降低分子量，但通常需要高温、强酸等苛刻条件，同时存在反应选择性差、副反应多等问题。酶解方法则在选择性和产物收率方面表现较好，但存在成本高、耗时长、适用性有限等缺点。相比之下，物理降解方法因其操作简便、条件温和、成本低以及易于扩大生产等优势，受到了越来越多的关注。其中，水动力空化（HC）是一种物理方法，通过液体流动时压力降低至低于其蒸气压，从而产生气-液泡，这些泡在达到最大尺寸后迅速崩溃，释放出大量能量并产生极端的局部温度和压力条件。HC不仅能通过机械效应（如局部高温、剪切力、微流、冲击波和微喷射）实现壳聚糖的降解，还能通过化学效应（如水分子在极端条件下分解产生•OH）促进氧化断裂。研究已表明，HC可以有效促进多糖中1,4-糖苷键的断裂，从而实现分子量的降低。

尽管HC已被用于壳聚糖的降解，但尚未有研究将其与H?O?结合使用，这可能是一个重要的研究空白。因此，本研究旨在探索HC与H?O?协同作用对壳聚糖降解的增强效应，并建立•OH的形成与壳聚糖降解效率之间的关联。实验中，我们系统地研究了空化强度、H?O?浓度以及样品制备方法等因素对壳聚糖降解效果的影响。通过使用尺寸排阻色谱（SEC）结合多角度光散射（MALS）和折射率检测器（RI），我们监测了壳聚糖分子量的变化。同时，利用FTIR、NMR和UV-Vis光谱技术评估了壳聚糖结构的变化，而XRD、DSC和TGA分析则用于研究其结晶度和热性能的变化。

研究结果显示，使用H5孔板（5个孔）在700 kPa压力差下进行HC处理，能够显著降低壳聚糖的分子量。例如，在800次空化循环后，壳聚糖的重均分子量从710 kDa降至250 kDa，而通过调整pH值至更高水平（如6、7或8.5）进一步促进了壳聚糖的降解，使得分子量降至170 kDa甚至30 kDa。这些结果表明，pH值对壳聚糖的降解效率有重要影响，尤其是在中性或弱碱性环境中，•OH的生成更为显著，从而加速了壳聚糖的降解过程。同时，我们还发现，将壳聚糖预先溶解在酸性条件下（pH 4.4）后再进行HC处理，其降解效果优于直接在中性或弱碱性条件下处理的壳聚糖。这可能是因为在酸性条件下，壳聚糖更易与•OH反应，从而提高了降解效率。

此外，我们还观察到，H?O?的添加能够显著增强•OH的生成，从而进一步提高壳聚糖的降解效率。例如，在700 kPa和800次空化循环下，H?O?的加入使得壳聚糖的重均分子量从510 kDa降至250 kDa。通过分析SA的降解产物，我们间接验证了•OH的生成情况，并发现H?O?的浓度和空化条件对•OH的生成有显著影响。高浓度的H?O?和高压力差均有助于•OH的形成，从而提高壳聚糖的降解效率。相比之下，较低的孔数虽然也能促进空化，但其•OH生成效率不如高孔数的孔板。

本研究还探讨了不同样品制备方法对壳聚糖降解的影响。当壳聚糖以溶液、凝胶或悬浮液的形式存在时，其降解效果有所不同。在酸性条件下溶解的壳聚糖在HC处理后表现出更显著的降解效果，而凝胶和悬浮液则由于氢键网络的存在，导致降解效率相对较低。这说明壳聚糖的物理状态对其降解过程具有重要影响，酸性条件下的壳聚糖更易被•OH攻击，从而实现更高效的降解。另一方面，当壳聚糖在中性或弱碱性条件下被处理时，其降解速度更快，但需要更长时间的反应过程。

在结构分析方面，我们发现，降解后的壳聚糖保留了其原始的主链结构，但部分糖苷键被•OH氧化断裂，形成了一些发色团。这些发色团主要位于链端，但由于其浓度较低，未能在FTIR和NMR中被明显检测到。XRD分析显示，降解后的壳聚糖结晶度与原始壳聚糖基本一致，表明其结晶结构未发生显著变化。DSC和TGA分析进一步确认了降解后的壳聚糖在热性能方面与原始壳聚糖相似，但其热分解速度有所加快，这可能与链端发色团的形成有关。

综上所述，本研究展示了一种结合水动力空化和H?O?的新型降解方法，该方法在常温下即可实现壳聚糖的有效降解，且能保留其主链结构。这一发现为低分子量壳聚糖的绿色和可持续生产提供了新的思路。此外，本研究还强调了空化强度、H?O?浓度、样品制备方法和反应后处理等因素对降解效果的重要影响，为后续研究提供了重要的参考。未来的研究可以进一步探索降解产物的详细组成，以更深入地理解降解机制，并优化反应条件，提高产物的生物活性和应用价值。