YBX1依赖的m5C修饰上调RNF115基因表达，促进了肝细胞癌的进展

《npj Precision Oncology》：RNF115 upregulation by YBX1-dependent m5C modification promotes hepatocellular carcinoma progression

YBX1通过识别m5C修饰的RNF115 mRNA增强其稳定性和翻译，激活PI3K/AKT通路促进肝细胞癌恶性表型，并揭示YBX1/m5C-RNF115轴作为诊断和治疗靶点的潜力。

　　肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的第三大原因，预计到2025年，其新发病例将超过一百万例。尽管在手术切除、局部治疗和分子靶向治疗方面取得了进展，HCC患者的长期预后仍不理想。例如，约30%的患者对多激酶抑制剂索拉非尼有初始反应，但通常在六个月后出现耐药性，导致5年生存率持续低下。这些挑战凸显了深入理解HCC发病机制并寻找更有效的治疗靶点的重要性。

近年来，动态RNA修饰被发现是调控转录后基因表达的重要机制，影响多种生理和病理过程。其中，5-甲基胞嘧啶（m5C）是一种广泛存在于mRNA和多种非编码RNA中的修饰，包括tRNA、rRNA、snRNA和eRNA。m5C的调控涉及三类蛋白质：甲基转移酶（writers）、去甲基化酶（erasers）和阅读蛋白（readers）。NSUN家族的甲基转移酶，尤其是NSUN2，在多种癌症中表现出高表达，促进m5C水平的升高，并有助于肿瘤进展和药物耐受性的形成。而去甲基化酶如TET家族则通过RNA去甲基化实现修饰的可逆性。阅读蛋白，如ALYREF和YBX1，识别并结合m5C修饰位点，对mRNA的输出、稳定性和翻译起始等过程产生关键影响。YBX1尤其在多种癌症中被发现能够靶向具有m5C修饰的癌基因，如HDGF、CHD3、HGH1、ENO1和SMOX，从而增强其稳定性并推动癌症发展。研究表明，YBX1能够识别约60%的m5C修饰mRNA。尽管YBX1在HCC中的致癌作用已被证实，但其在HCC中靶向m5C修饰mRNA的具体功能仍不明确。

本研究通过全基因组范围内的m5C修饰分析，揭示了HCC中m5C修饰模式的显著异质性，且差异修饰基因在所有染色体上广泛分布，唯独Y染色体未见明显变化。Y染色体仅包含约78个蛋白质编码基因，且其转录活性相对较低。越来越多的证据表明，Y染色体在多种癌症中经历不同程度的转录沉默，包括HCC。此外，HCCDB数据库的数据也未检测到Y染色体基因在HCC中的显著差异表达。这些观察结果暗示，Y染色体的转录沉默可能与HCC中Y染色体相关基因的m5C修饰减少有关，这一假设值得进一步探索，以揭示Y染色体失活在HCC中的表观遗传机制。

我们发现YBX1在HCC组织中显著上调，并与较差的患者预后密切相关。功能研究表明，YBX1能够促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭，无论是体外还是体内实验均得到验证。为了进一步揭示YBX1的下游靶标，我们结合了m5C MeRIP-seq、m5C RNA-BisSeq、YBX1 RIP-seq以及CRISPR介导的YBX1敲除数据。通过交集分析，我们筛选出七种候选基因，其中RNF115在HCC组织中表现出显著的mRNA和蛋白高表达。通过批量和单细胞RNA测序的关联分析，我们发现RNF115的表达水平与YBX1和NSUN2呈正相关。荧光免疫染色进一步验证了YBX1和RNF115蛋白表达之间的强正相关性。Cox回归分析显示，YBX1和RNF115均是HCC独立的预后风险因素。此外，ROC曲线分析表明，YBX1和RNF115在多个数据集中具有较高的诊断准确性，突显了它们在HCC中的临床重要性。

进一步的实验发现，YBX1的敲除或NSUN2的敲除显著降低了RNF115的表达水平，而YBX1或NSUN2的过表达则显著提高了RNF115的表达。值得注意的是，YBX1的野生型（YBX1-WT）和NSUN2的野生型（NSUN2-WT）能够增强RNF115的表达，而突变型（YBX1-MT和NSUN2-DM）则无法实现这一效果。此外，通过m5C修饰位点的分析，我们确定了RNF115 mRNA中三个潜在的YBX1结合位点，位于其3’非翻译区（3’UTR）。构建的荧光素酶报告载体实验表明，YBX1的敲除显著降低了野生型和单点突变型RNF115的荧光素酶活性，但对三重突变型RNF115-MT没有影响。RIP-qPCR分析进一步证实了YBX1蛋白直接结合RNF115 mRNA，而非RNF115-MT mRNA，表明m5C修饰位点对于YBX1与RNF115 mRNA的相互作用至关重要。此外，mRNA稳定性实验显示，YBX1的敲除不会显著影响RNF115-MT的降解速率，这表明m5C修饰位点的缺失可以消除YBX1对mRNA稳定性的调控作用。这些结果进一步支持YBX1通过m5C修饰增强RNF115表达的机制。

RNF115，也被称为乳腺癌相关基因2（BCA2），在多种癌症中被广泛研究，包括肺腺癌、胃癌、乳腺癌和甲状腺癌。然而，其作为YBX1靶标在HCC中的功能尚不明确。与其他YBX1靶标如SMOX、HDGF、CHD3和ENO1不同，RNF115作为一种E3泛素连接酶，通过泛素-蛋白酶体系统直接调控蛋白质稳态。这种独特的多功能性使RNF115成为连接RNA修饰与蛋白质稳态、细胞信号、DNA修复和免疫调节的关键节点。YBX1作为一种多功能RNA结合蛋白，已知参与关键的癌症相关过程，包括蛋白质稳态、应激反应、DNA损伤修复以及转录因子如MYC的激活。YBX1和RNF115的共同过表达提示可能存在协同调控机制，可能协调多种癌症特征，如持续的增殖信号、对凋亡的抵抗、基因组不稳定性以及蛋白质稳态的破坏。鉴于RNF115在这一调控轴中的核心地位，它可能在HCC进展中扮演更整合的角色。

我们的研究还发现，RNF115不仅在HCC组织中高度表达，还与疾病的晚期阶段和较差的生存率密切相关。体外和体内实验均表明，RNF115的敲除显著抑制了HCC细胞的增殖和转移能力。更重要的是，RNF115的过表达能够部分恢复YBX1敲除导致的增殖和侵袭能力缺陷，表明RNF115是YBX1在HCC中致癌作用的重要下游效应器。尽管我们已经确认了YBX1与RNF115之间的调控关系，但仍需进一步研究以确定其他YBX1靶标是否也参与HCC进展，并探索其在HCC治疗中的全面作用。此外，采用更先进的实验模型，如原位肝癌模型和患者来源异种移植模型，以及研究YBX1/m5C-RNF115轴如何影响对索拉非尼的敏感性，对于推动研究的临床转化至关重要。

在机制层面，我们的数据表明，YBX1/m5C-RNF115轴可能通过激活多个致癌通路促进HCC进展，包括未折叠蛋白反应、G2/M检查点调控、MYC靶标激活、DNA修复和PI3K/AKT信号通路。其中，PI3K/AKT通路尤为引人关注，因为它在大约50%的HCC患者中异常激活，并与较差的预后和对索拉非尼的耐药性密切相关。实验结果证实，YBX1/m5C-RNF115轴能够直接调控PI3K和AKT的磷酸化状态。使用AKT磷酸化抑制剂MK-2206进行的挽救实验进一步表明，抑制AKT信号能够有效逆转RNF115过表达诱导的增殖效应。这些发现进一步支持了YBX1/m5C-RNF115轴通过调控PI3K/AKT通路促进HCC进展的假设。文献指出，针对PI3K/AKT通路的联合治疗策略可能有助于克服耐药性和毒性问题。我们的研究提供了初步证据，表明RNA甲基化、泛素化和PI3K/AKT信号通路之间存在协同调控机制，为未来联合靶向治疗策略提供了新的理论依据和潜在方向。尽管我们的研究重点在于PI3K/AKT通路，但RNF115作为E3泛素连接酶，可能还调控其他多种致癌通路。例如，已有研究表明RNF115通过APC泛素化激活Wnt/β-连环蛋白信号通路在肺部癌症中起作用，而其他RNF家族成员则在多种癌症中调控MAPK信号通路。这些潜在的多通路效应可能进一步解释RNF115在HCC中的强大致癌活性。未来通过泛素组分析，可以更全面地描绘YBX1/m5C-RNF115轴调控的信号网络，从而发现更多潜在的治疗靶点。

综上所述，我们的研究揭示了YBX1/m5C-RNF115轴在HCC进展中的关键作用，通过激活PI3K/AKT信号通路促进肿瘤发展。这些发现不仅突显了这一调控轴在HCC发病机制中的核心地位，还为HCC的诊断和治疗提供了新的思路。针对YBX1/m5C-RNF115轴的干预，无论是单独使用还是与PI3K/AKT通路抑制剂联合应用，都可能成为开发更有效HCC治疗方法的有力策略。