犬支原体（Mycoplasma cynos）和猫支原体（Mycoplasma felis）的抗菌素敏感性及其耐药性和毒力的基因组决定因素

《The Veterinary Journal》：Antimicrobial susceptibility and genomic determinants of resistance and virulence in Mycoplasma cynos and Mycoplasma felis

犬猫呼吸道支原体抗菌药敏感性及耐药基因与致病机制研究。采用 broth microdilution 法测定 6 种抗生素最小抑菌浓度（MICs），发现所有菌株对四环素类（MIC≤0.25 μg/mL）高度敏感，而氟喹诺酮类（恩诺沙星、马波沙星）和 макролид类（阿奇霉素）存在耐药性。通过纳米孔测序和杂交基因组组装，鉴定到gyrA 基因突变（Tyr154Ala/Ile 和 Glu87Gln/Val）与氟喹诺酮类耐药相关，23S rRNA 基因突变（A2058G 和 C1187T）与 макролид类耐药相关，并发现犬支原体存在Val43Leu 突变的新耐药位点。基因组分析揭示两类支原体均携带粘附相关基因（如 Opp 运营子）和免疫逃逸蛋白（如 MIP）。该研究首次建立犬猫支原体基因组与抗菌药敏感性的关联，为临床合理用药提供依据。

　　随着对犬猫呼吸道疾病研究的深入，越来越多的科学家开始关注一些特殊的病原体——*Mycoplasma cynos* 和 *Mycoplasma felis*。这两种细菌是犬和猫呼吸道感染的重要病原体，但因其特殊的生物学特性，如缺乏细胞壁、代谢途径不完整等，使得它们在实验室培养过程中面临较大挑战。这些特性不仅限制了对它们的病原学研究，也影响了抗菌药物的筛选和治疗方案的制定。因此，本研究旨在通过体外抗菌药物敏感性测试和基因组分析，揭示这两种细菌的抗菌药物耐药性机制及潜在的致病性基因，为临床治疗提供更科学的依据。

### 研究背景与意义

*Mycoplasma cynos* 和 *Mycoplasma felis* 通常与犬的“犬群咳嗽”（Canine Infectious Respiratory Disease Complex, CIRDC）和猫的“猫呼吸道疾病复合体”（Feline Respiratory Disease Complex, FRDC）相关。这些疾病在临床上表现出高度的传染性和多样性，症状可以从轻微的咳嗽和打喷嚏发展到严重的气管支气管炎甚至致命性肺炎。尽管这两种细菌在临床上被广泛认为是重要病原体，但由于它们难以在常规培养基上生长，目前对它们的致病机制、抗菌药物敏感性以及诊断方法的研究仍然有限。现有的治疗方案多为经验性用药，缺乏针对性的体外抗菌药物敏感性数据，导致治疗效果难以评估。

此外，*Mycoplasma* 属于一种特殊的原核生物，其缺乏细胞壁和完整的代谢途径，使得它们天然对β-内酰胺类抗生素（如青霉素和头孢类）及磺胺类药物不敏感。同时，由于其基因组较小且基因组结构高度可变，*Mycoplasma* 在耐药性方面表现出较高的灵活性。这使得研究其耐药性机制和致病性特征变得尤为重要。尤其是近年来，其他*Myco*plasma物种如*M. pneumoniae*、*M. bovis*等对氟喹诺酮类和大环内酯类药物的耐药性逐渐增加，这引发了对犬猫*Myco*plasma是否也存在类似耐药性机制的关注。

本研究首次系统地评估了*M. cynos*和*M. felis*的体外抗菌药物敏感性，并通过基因组分析揭示了其耐药性和致病性相关的遗传标记。这些发现不仅有助于理解这两种细菌的致病机制，还为临床制定更有效的治疗方案提供了科学依据。

### 方法与技术

为了评估抗菌药物的体外敏感性，研究团队开发了一种适用于这两种细菌的微量肉汤稀释法。该方法基于CLSI M43-A标准，并结合了商业培养基（SP4葡萄糖肉汤）和一种经过优化的“超级改良Hayflick肉汤”。通过这种方法，研究者能够准确地测定多种抗菌药物的最小抑制浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC），包括多西环素、四环素、米诺环素、恩诺沙星、马波沙星和阿奇霉素。此外，为了确保结果的可靠性，研究团队还对每种药物的MIC值进行了重复测试，并在必要时对结果不一致的样本进行了重新评估。

在基因组层面，研究团队使用了Oxford Nanopore和Illumina联合测序技术，构建了*M. cynos*和*M. felis*的混合基因组。这一方法不仅提高了基因组组装的准确性，还允许研究者对耐药性和致病性相关的基因进行深入分析。通过基因组比对和序列分析，研究团队识别了多个与抗菌药物耐药性相关的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs），包括与氟喹诺酮类药物耐药性相关的*gyrA*基因突变和与大环内酯类药物耐药性相关的23S rRNA基因突变。此外，研究还发现了*M. felis*中一种新型的50S核糖体蛋白L4的突变，可能与阿奇霉素的耐药性有关。

为了进一步揭示这些细菌的致病机制，研究团队还对基因组中与粘附、免疫逃逸、生物膜形成和细胞损伤相关的潜在致病基因进行了分析。这些基因的鉴定基于序列同源性和文献资料，结合了Bakta程序进行编码序列（CDS）的独立分类注释，并利用BLASTp和UniProt数据库进行功能预测。结果显示，粘附和免疫逃逸相关的基因在两种细菌中均较为丰富，而生物膜相关的基因则在*M. cynos*和*M. felis*中均表现出一定的保守性。

### 体外抗菌药物敏感性分析结果

研究结果表明，*M. cynos*和*M. felis*对四环素类药物表现出较高的体外敏感性。所有12个*M. cynos*和16个*M. felis*临床分离株在最低浓度下均被抑制，且未发现与四环素耐药性相关的16S rRNA基因突变或*tet(M)*基因。这一发现支持了四环素类药物作为治疗犬猫*Mycoplasma*呼吸道感染的一线选择。相比之下，氟喹诺酮类药物的敏感性则表现出较大的差异。在*M. cynos*中，3/12（25%）的分离株在*gyrA*基因中发现了与耐药性相关的突变，这些突变与恩诺沙星和马波沙星的高MIC值相关。而在*M. felis*中，5/16（31.3%）的分离株在*gyrA*基因中发现了与耐药性相关的突变，包括Ser137Tyr、Glu141Gln/Gly和Asp150Asn等，这些突变与阿奇霉素的高MIC值相关。值得注意的是，*M. felis*中还发现了一种新型的50S核糖体蛋白L4突变（Val43Leu），该突变在所有MIC值高于64 μg/mL的分离株中均存在，表明其在阿奇霉素耐药性中可能发挥重要作用。

此外，研究团队还发现，部分*M. felis*分离株在23S rRNA基因中存在C1187T突变，这可能与阿奇霉素的中等耐药性有关。这些结果表明，尽管*M. cynos*和*M. felis*对四环素类药物表现出较高的敏感性，但它们对氟喹诺酮类和大环内酯类药物的耐药性可能因基因突变而不同。对于阿奇霉素的耐药性，*M. felis*显示出比*M. cynos*更高的MIC值，这可能与其天然的耐药性机制有关。研究团队还提到，某些*Mycoplasma*物种如*M. hominis*对大环内酯类药物存在天然耐药性，而*M. felis*的MIC值与这些物种相似，这可能意味着其对阿奇霉素的耐药性部分是固有的。

### 耐药性与致病性基因的发现

在耐药性方面，研究团队发现*M. cynos*和*M. felis*的基因组中存在多种与抗菌药物耐药性相关的突变。这些突变主要集中在*gyrA*基因和23S rRNA基因，分别与氟喹诺酮类和大环内酯类药物的耐药性有关。此外，研究还发现*M. felis*中存在一种新型的50S核糖体蛋白L4突变（Val43Leu），该突变可能通过改变药物与核糖体的结合方式，导致阿奇霉素的耐药性增加。这些发现不仅揭示了这两种细菌的耐药性机制，还为未来的耐药性监测和药物开发提供了新的方向。

在致病性方面，研究团队通过基因组分析发现，*M. cynos*和*M. felis*的基因组中存在多个与粘附、免疫逃逸和生物膜形成相关的潜在致病基因。这些基因的鉴定基于其与已知致病性*Mycoplasma*物种的序列同源性，如*M. hyopneumoniae*和*M. gallisepticum*。粘附因子在*Mycoplasma*的致病过程中起着关键作用，它们能够帮助细菌附着在宿主的黏膜表面，从而增强其感染能力。此外，研究还发现，某些蛋白如DnaK和延伸因子Tu可能在粘附过程中起到辅助作用。免疫逃逸机制则主要通过*Mycoplasma*免疫球蛋白结合蛋白（MIB）和免疫球蛋白蛋白酶（MIP）实现，这些蛋白能够干扰宿主的免疫反应，帮助细菌在宿主体内长期存活。

生物膜的形成是*Mycoplasma*致病性的重要特征之一，它不仅有助于细菌在宿主组织中定植，还可能增加其对宿主免疫系统的抵抗能力。研究团队通过比对*M. gallisepticum*的基因组，发现*M. cynos*和*M. felis*的基因组中存在多个与生物膜形成相关的编码序列，如*Opp*操纵子，该操纵子负责将大分子运输到细胞外环境。在液体培养中，研究者观察到*M. cynos*和*M. felis*形成了小的细胞聚集，这可能是生物膜形成的一个前兆，表明它们在宿主组织中具有一定的附着和聚集能力，从而增强其致病性。

### 临床意义与未来研究方向

本研究的发现具有重要的临床意义。首先，它为犬猫*Mycoplasma*呼吸道感染的治疗提供了新的依据。四环素类药物因其高敏感性和低耐药性，被推荐为一线治疗药物。然而，氟喹诺酮类和大环内酯类药物的耐药性问题仍需进一步关注。特别是*M. felis*对阿奇霉素的耐药性较高，这可能意味着在某些情况下，阿奇霉素的使用效果有限，需要谨慎选择。

其次，本研究揭示了*M. cynos*和*M. felis*的耐药性和致病性机制，为未来的耐药性监测和治疗策略的优化提供了重要信息。例如，研究团队发现*M. felis*中存在一种新型的50S核糖体蛋白L4突变，这可能为开发新的耐药性检测方法和靶向药物提供线索。此外，粘附和免疫逃逸机制的研究有助于理解这些细菌如何在宿主中生存并导致疾病，为疫苗开发和免疫疗法提供了潜在方向。

最后，研究团队还提到，未来的研究需要进一步探讨其他抗菌药物对*M. cynos*和*M. felis*的敏感性，特别是其他大环内酯类药物。此外，关于*Mycoplasma*的生物膜形成机制及其对抗菌药物耐药性的影响，仍需更深入的研究。这些发现不仅有助于改善当前的治疗策略，还可能为预防和控制这些细菌引起的呼吸道疾病提供新的思路。

综上所述，本研究通过体外抗菌药物敏感性测试和基因组分析，首次系统地揭示了*M. cynos*和*M. felis*的耐药性和致病性机制。这些发现为临床治疗提供了科学依据，也为进一步研究这些细菌的致病性和耐药性奠定了基础。未来的研究应继续关注抗菌药物的选择和使用，以及这些细菌在宿主中的致病机制，以期找到更有效的防控措施。