比较分析Haemaphysalis longicornis和Hyalomma dromedarii蜱虫中微生物病原体多样性

《Veterinary Parasitology》：Comparative metagenomic profiling of microbial pathogen diversity in Haemaphysalis longicornis and Hyalomma dromedarii ticks

蜱虫作为人畜共患病病原体传播者，本研究通过宏基因组测序分析了中国甘肃省张佳泉（湿润）和民勤县（干旱）的两种蜱虫（Rhipicephalus microplus和 Hyalomma dromedarii）的微生物群落。发现两蜱虫在核心基因（2040个）上高度保守，但物种间存在显著差异（H. microplus携带43,937个独特基因，H. dromedarii达148,768个），且与宿主和地理环境相关。检测到19%的Anaplasma phagocytophilum和28-44%的Klebsiella pneumoniae，并发现新型病毒（如Trachysalambria curvirostris nimavirus占比59-69%）。抗生素抗性基因分析显示HL.CNo1以vanT（99.54%）为主，HL.SNo2含有多种ARG（如cmx 4.32%，marA 4.34%），HD.ANo3以vanY（92.89%）为特征。研究证实蜱虫微生物群具有环境特异性，为区域疾病防控提供依据。

　　本文探讨了中国甘肃省两种蜱虫——Haemaphysalis longicornis 和 Hyalomma dromedarii 中的微生物群落特征，揭示了这些蜱虫在不同环境条件下作为病原体传播媒介的重要作用。研究通过宏基因组测序技术，全面分析了这些蜱虫体内携带的细菌、病毒及其他微生物的组成，为理解蜱传疾病的潜在风险提供了新的视角，并强调了在不同地区开展针对性监测的必要性。

### 蜱虫的生态与病原体传播

蜱虫是重要的节肢动物媒介，能够传播多种微小病原体，包括病毒、细菌、原生动物和真菌等，这些病原体可以感染脊椎动物和人类。它们在不同生态环境中广泛分布，与宿主之间的互动复杂多样，从而成为疾病传播的关键因素。长期以来，人们对蜱虫携带的病原体研究主要依赖于传统的16S/18S rRNA扩增子测序或靶向PCR技术，这些方法在检测RNA病毒和那些尚未完全分类的微生物方面存在局限性。因此，研究团队采用了一种更为全面的宏基因组测序方法，以更深入地了解蜱虫微生物组的组成及其功能潜力。

### 研究方法与样本采集

研究团队在甘肃省的两个不同地区采集了样本：一个是湿润的张掖市张掖县（Zhangjiachuan County），另一个是干旱的民勤县（Minqin County）。在张掖县，共采集了236只来自牛的H. longicornis样本（HL.CNo1），而在民勤县，采集了198只来自羊的H. longicornis样本（HL.SNo2）以及165只来自骆驼的Hy. dromedarii样本（HD.ANo3）。样本采集时间覆盖了2024年3月至7月，这有助于捕捉不同季节中蜱虫微生物群落的变化。采集后的样本经过形态学鉴定，确保了其分类准确性，随后被保存在-80°C的低温环境中以保持其完整性。

为了提取样本中的DNA，研究人员使用了PBS缓冲液进行表面灭菌，然后通过机械方法进行匀浆处理。提取的DNA使用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒进行纯化，并通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。DNA浓度则使用NanoDrop 2000仪器进行测量。在处理过程中，来自同一地区的样本被等量混合，以减少个体差异对结果的影响。

### 测序与生物信息学分析

DNA片段化后，使用Covaris LE220超声仪将其切割为约350 bp的片段。随后，使用Hieff NGS? Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Module试剂盒构建测序文库，经过连接接头、PCR扩增和尺寸选择后，文库被Qubit 2.0和qPCR仪器进行定量检测，确保有效浓度超过3 nM。最终，所有文库在Illumina NovaSeq平台上进行测序，采用PE150双端测序模式，以获得高质量的原始数据。

在数据处理阶段，首先使用Trimmomatic（v0.39）对原始数据进行质量控制，通过滑动窗口（SLIDINGWINDOW:4:20）和最小长度（MINLEN:50）过滤低质量的reads。随后，使用Bowtie2（v2.4.4）将宿主来源的reads与参考基因组（如牛的Bos taurus ARS-UCD1.3、羊的Ovis aries Oar v4.0、骆驼的Camelus bactrianus CamBac_2.0）比对，从而去除宿主DNA的干扰。剩余的非宿主reads通过MEGAHIT（v1.2.9）进行从头组装，并设置参数--meta-sensitive preset以提高组装效率。所有大于等于500 bp的scaffold被保留，并使用MetaGeneMark进行开放阅读框（ORF）预测。

在基因目录构建方面，ORFs通过CD-HIT进行去冗余处理，设置参数为95%的序列相似性和90%的覆盖度（-c 0.95 -G 0 -aS 0.9 -g 1 -d 0）。基因丰度的计算基于reads的数量和基因长度的比值，这一方法有助于评估不同微生物在样本中的相对重要性。通过这种方式，研究团队能够系统地识别和量化蜱虫微生物组中的各类微生物。

### 微生物与病毒的组成分析

研究结果显示，所有样本中细菌占主导地位，其中Klebsiella pneumoniae和Anaplasma phagocytophilum的丰度较高。K. pneumoniae是一种机会性病原体，可以在多种宿主中引起感染，这提示了蜱虫可能在细菌传播中扮演重要角色。而A. phagocytophilum是一种人畜共患病原体，能够通过蜱虫传播给人类，对公共卫生构成威胁。此外，研究还检测到了Coxiellaceae和Rickettsiaceae等家族的成员，这些家族中包含一些已知的蜱传病原体。

病毒的丰度相对较低，仅占总reads的0.2–0.3%。然而，它们主要由nimavirus（如Trachysalambria curvirostris和Hemigrapsus takanoi）构成，占病毒reads的70%以上。这种高丰度可能反映了蜱虫与无脊椎动物宿主之间的生态互动，或者与特定环境暴露有关。此外，研究还检测到了与寄生蜂相关的bracovirus，这表明蜱虫可能通过间接途径与其他生物体发生相互作用，成为更广泛生态网络的一部分。

### 功能潜力与抗药性基因分析

通过多个数据库的注释，研究团队分析了样本的功能潜力。结果显示，代谢功能占据了所有功能注释的大约30%，随后是遗传信息处理、生物体系统、环境信息处理以及细胞过程。这些发现与节肢动物微生物组的研究结果一致，表明蜱虫微生物组在维持宿主生理功能和适应环境方面发挥着重要作用。值得注意的是，多个与人类疾病相关的微生物种类被识别出来，进一步支持了蜱虫作为病原体传播媒介的重要性。

在抗药性基因（ARGs）分析方面，不同样本中ARGs的分布存在显著差异。例如，HL.CNo1样本中vanT基因的丰度高达99.54%，而HL.SNo2样本中则包含了多种ARGs，如lnuA、soxS、marA等。HD.ANo3样本主要携带vanY基因，其丰度为92.89%。这些差异可能反映了不同地区环境中抗生素使用情况的不同，从而影响了蜱虫微生物组中抗药性基因的分布。研究团队还通过Krona和circos图对ARGs的分布进行了可视化，便于比较不同样本之间的差异。

### 生态与公共卫生意义

研究结果表明，蜱虫的微生物群落组成受到其种类、地理来源和宿主影响。尽管H. longicornis在不同宿主和地理区域之间表现出较高的相似性，但与Hy. dromedarii相比，其微生物组成存在显著差异。这提示我们，蜱虫的物种差异可能是其微生物群落结构不同的主要原因。此外，研究还发现，不同样本中携带的病原体种类和丰度存在差异，这可能与当地生态环境和宿主种类有关。

在公共卫生方面，研究结果强调了蜱虫作为病原体传播媒介的重要性。特别是A. phagocytophilum和K. pneumoniae的高丰度，提示这些病原体可能在蜱虫体内长期共存，并具有潜在的传播能力。因此，对蜱虫微生物组的深入研究不仅有助于理解其生态功能，也为制定有效的病原体防控策略提供了科学依据。

### 方法学的局限性与未来方向

尽管宏基因组测序技术为研究蜱虫微生物组提供了强大的工具，但研究仍存在一定的方法学限制。例如，使用最低共同祖先（LCA）方法进行分类可能会影响分类的准确性，而较短的contig长度可能会影响基因预测的可靠性。为了提高研究的精确度，未来可以考虑采用长读长测序技术或进行菌株级别的分析。此外，研究样本数量和地理范围有限，未能全面覆盖不同生态环境和宿主类型。因此，扩大样本范围并结合其他方法（如基于培养的实验）将有助于更全面地了解蜱虫微生物组的多样性及其在不同环境中的作用。

### 结论

本研究通过宏基因组测序技术，系统地分析了中国甘肃省两种蜱虫的微生物群落特征，揭示了其在不同生态环境中作为病原体传播媒介的重要性。研究结果不仅为理解蜱传疾病的潜在风险提供了新的视角，也为制定针对性的监测和防控策略奠定了基础。未来的研究应进一步探索蜱虫微生物组的动态变化及其在不同宿主和环境中的适应性，以更好地应对蜱传疾病的挑战。