雪貂博来霉素肺纤维化模型再现人类特发性肺纤维化关键特征

《npj Regenerative Medicine》：Ferret model of bleomycin-induced lung injury shares features of human idiopathic pulmonary fibrosis

本研究针对特发性肺纤维化(IPF)缺乏有效疾病模型的瓶颈，构建了博来霉素诱导的雪貂肺纤维化(PF)模型。研究人员通过组织病理学、肺功能检测和单核RNA测序(snRNA-Seq)等技术证实，该模型成功复制了人类IPF的典型特征：不可逆的肺顺应性丧失、蜂窝囊肿样结构和远端肺上皮向近端表型转化。研究发现AT2细胞经KRT8high/KRT7low/SOX4+过渡状态分化为KRT8high/KRT7high/SFN+/TP63+/KRT5low基底样细胞，为IPF发病机制研究和治疗开发提供了更贴近人类的动物模型。

　　

肺纤维化领域长期面临一个严峻挑战：尽管小鼠模型被广泛使用，但它们往往难以真实模拟人类特发性肺纤维化(IPF)的复杂病理特征。IPF作为进行性肺部疾病，以肺架构破坏和细胞外基质(ECM)过度沉积为特征，最终导致呼吸衰竭。现有治疗手段有限，部分原因在于缺乏能够持续再现人类IPF关键特征的动物模型。传统小鼠模型通常表现为自限性疾病进程，纤维化可逆，且较少形成IPF典型的远端肺泡支气管化和蜂窝囊肿样结构。虽然近期研究表明老年小鼠经多次博来霉素损伤后可出现进行性纤维化，但物种间肺解剖结构和细胞生物学的差异仍限制了小鼠模型的临床预测价值。

在此背景下，研究人员将目光投向了与人类呼吸系统更为相似的雪貂模型。家养雪貂(Mustela putorius furo)因气道解剖结构、肺细胞生物学和生理功能与人类高度相似，已成为多种呼吸系统疾病研究的优选模型。本研究旨在系统评估博来霉素诱导的雪貂肺纤维化模型是否能够更好地模拟人类IPF的病理生理特征。

研究人员通过气管内给药方式对雪貂进行三次博来霉素(2.5 U·mL^-1·Kg^-1)损伤，系统观察了4、8和12周时的疾病进展。结果显示，博来霉素挑战后雪貂体重逐渐下降，多数动物在12周内达到人道终点。组织病理学分析显示，损伤后肺组织出现斑片状纤维化灶和蜂窝囊肿样结构，伴随显著胶原沉积。Ashcroft评分证实老年雪貂(≥11个月)对博来霉素损伤更敏感，与人类IPF年龄相关发病特征一致。血浆和肺组织中羟脯氨酸(HYP)含量显著升高，基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和胶原表达增加，进一步证实了纤维化进程。

影像学检查显示，博来霉素损伤后雪貂肺部出现弥漫性均匀高密度影，高衰减区域(HAA)增加。肺功能测试(PFT)发现，损伤后雪貂吸气容量(IC)显著降低，FEV_0.4/FVC比值升高，表现为限制性肺生理特征。准静态顺应性(Cst)和呼吸系统动态顺应性(Crs)下降，呼吸系统弹性(Ers)和阻力(Rrs)适度增加。值得注意的是，肺功能下降与组织病理学改变高度相关，且损伤后12周未见功能恢复，表明肺功能损害具有持续性。

为深入解析纤维化过程中的细胞特异性变化，研究人员对9只雪貂的114,125个远端肺细胞核进行了单核RNA测序(snRNA-Seq)分析。通过人类肺细胞图谱(HCLA)参考注释，成功鉴定了上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和免疫细胞等主要细胞类型，并识别出33个离散细胞簇。

上皮细胞分析揭示了10种不同的细胞类型/状态。与对照组相比，博来霉素损伤肺中AT1(51.41% vs. 48.59%)和AT2细胞(55.43% vs. 44.57%)比例下降，而过渡性AT2细胞(6.8% vs. 93.2%)和KRT7⁺细胞(0.49% vs. 99.51%)显著增加。俱乐部细胞、基底细胞、杯状细胞和纤毛细胞比例均升高，表明远端肺上皮出现"近端化"特征。免疫荧光染色证实SCGB1A1⁺和SCGB3A2⁺细胞在纤维化肺中增加，且部分细胞共表达AT2细胞标志物SFTPC(SPC)，类似于终末细支气管(TRB)特异性AT0细胞或呼吸气道分泌(RAS)细胞。

特别值得注意的是，研究发现博来霉素损伤肺远端实质出现支气管化特征，形成类似人类IPF的基底样细胞(KRT17⁺/TP63⁺/KRT5^low)。这些细胞位于纤维化区域的肌成纤维细胞上方，提示其在纤维化进展中发挥作用。KRT7表达出现在肺泡空间的AT1和AT2细胞中，部分TP63⁺细胞表现为KRT7⁺/KRT5^low表型，且KRT7⁺细胞与KRT8表达重叠。

从肺叶中央到外周的区域分析显示，KRT7⁺细胞逐渐获得KRT17和/或KRT5表达，形成异质性角蛋白表达模式。伪时间分析表明，雪貂AT2细胞通过多条轨迹分化：经过渡性AT2细胞(SFTPC^low/IGFBP7⁺/RTKN⁺/KRT8^low)向不成熟AT1细胞(AGER⁺/MYRF^low)和成熟AT1细胞(AGER⁺/MYRF^high)分化；或经KRT8^high/KRT7^high/SOX4⁺状态向KRT8^high/KRT7^high/SFN⁺/TP63⁺/KRT5^low基底样细胞转化。

间充质细胞分析揭示了6个明显分离的细胞簇：外膜成纤维细胞(DCN⁺/FBLN1⁺/PI16⁺)、肺泡成纤维细胞(PDGFRA⁺/TCF21⁺)、间皮细胞(WT1⁺)、肌成纤维细胞和平滑肌细胞(ACTA2⁺/CNN1⁺)、周细胞(PDE5A⁺)以及过渡性肺泡成纤维细胞。博来霉素损伤后，肌成纤维细胞和间皮细胞比例显著增加，伴随胶原基因表达上调。免疫荧光显示CNN1⁺/ACTA2⁺活化肌成纤维细胞增多，且与Ashcroft评分正相关。

细胞互作分析预测，KRT7⁺过渡细胞可能分泌TGFB和EREG配体，与各种成纤维细胞亚型受体相互作用。IGF1由外膜和过渡成纤维细胞表达，相应受体(IGFR1)存在于KRT7⁺过渡细胞和AT2细胞中，提示上皮-间质相互作用在纤维化进展中的关键作用。

本研究成功建立了博来霉素诱导的雪貂急性肺损伤模型，该模型发展为类似人类IPF的慢性发育异常再生性疾病。模型重现了人类IPF的关键组织病理学、细胞和分子特征，包括纤维化灶形成、蜂窝囊肿样结构、支气管化以及异常KRT7⁺/KRT17⁺/KRT5^-/low/TP63⁺细胞出现。与小鼠模型相比，雪貂模型在肺解剖结构、细胞生物学和疾病机制方面与人类更为接近，为IPF病理生理学研究提供了更有价值的平台。

研究强调，雪貂模型再现了IPF纤维化从胸膜表面或叶间隔向肺叶中心进展的独特解剖学特征。snRNA-Seq分析和免疫染色揭示了异常的成纤维细胞和肌成纤维细胞分化，以及ECM积累，与人类IPF和小鼠模型相似。KRT7⁺细胞位于肌成纤维细胞灶外，分隔纤维化灶和相邻过渡性AT2细胞，提示这些细胞可能在成纤维细胞和AT2细胞间互作中起中介作用。

尽管本研究存在某些局限性，如博来霉素重复给药导致纤维化表型快速出现，限制了晚期慢性纤维化动物的积累，但雪貂模型无疑为IPF研究提供了更贴近人类的实验平台。未来研究可利用此模型探索细胞机制并测试IPF疗法，有望弥合临床前发现与人类临床应用之间的差距。

关键技术方法概述

研究采用博来霉素气管内给药建立雪貂肺纤维化模型，通过肺功能测试系统评估呼吸力学参数，计算机断层扫描(CT)定量肺 opacity变化，组织病理学采用Ashcroft评分和Masson三色染色评估纤维化程度，单核RNA测序(snRNA-Seq)分析细胞组成和转录组变化，免疫荧光染色验证关键蛋白表达和定位，细胞互作分析预测配体-受体相互作用网络。

研究结果

博来霉素诱导雪貂肺出现类似人类IPF的组织病理学和生化特征

三次博来霉素损伤后，雪貂体重逐渐下降，组织病理学显示斑片状纤维化灶和蜂窝囊肿样结构，伴随显著胶原沉积。老年雪貂(≥11个月)对损伤更敏感，Ashcroft评分更高，与人类IPF年龄分布一致。血浆中KL-6、SFTPA、SFTPD、MUC5AC、MUC5B、MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-7等IPF生物标志物水平显著升高。

影像学和肺功能检测揭示博来霉素损伤雪貂肺的纤维化临床表现

CT显示弥漫性均匀高密度影，高衰减区域增加。肺功能测试发现吸气容量显著降低，FEV_0.4/FVC比值升高，准静态顺应性和呼吸系统动态顺应性下降，表明肺顺应性降低。肺功能下降与组织病理学改变高度相关，且损伤后12周未见恢复。

博来霉素损伤雪貂肺中出现多样异常上皮细胞表型

snRNA-Seq分析显示AT1和AT2细胞比例下降，过渡性AT2细胞和KRT7⁺细胞显著增加，远端肺上皮呈现"近端化"特征。免疫荧光证实SCGB1A1⁺和SCGB3A2⁺细胞增加，部分共表达SFTPC，类似AT0/RAS细胞。MUC5B⁺细胞在纤维化区域出现，部分共表达SCGB3A2。

博来霉素诱导雪貂肺远端实质支气管化

研究发现KRT17⁺/TP63⁺/KRT5^low基底样细胞在支气管化样结构中出现。KRT7表达出现在肺泡细胞中，部分TP63⁺细胞表现为KRT7⁺/KRT5^low表型。从肺叶中央到外周，上皮细胞角蛋白表达呈现梯度变化，KRT7⁺细胞逐渐获得KRT17和KRT5表达。

博来霉素损伤雪貂肺中的间充质细胞动态

间充质细胞分析识别出6个细胞簇，博来霉素损伤后肌成纤维细胞和间皮细胞比例增加，胶原基因表达上调。免疫荧光显示活化肌成纤维细胞增多，胶原1A1和KRT7⁺细胞围绕肌成纤维细胞灶分布，AT2细胞散布其间。

结论与意义

本研究建立的博来霉素诱导雪貂肺纤维化模型成功再现了人类IPF的关键特征，包括不可逆的肺功能下降、远端肺支气管化、细胞状态转变和ECM沉积增加。与小鼠模型相比，雪貂模型在解剖结构和细胞生物学方面与人类更为接近，特别是存在呼吸性细支气管和RAS/TRB-SC祖细胞群，这些结构在小鼠中缺失。模型为研究IPF发病机制和测试新型疗法提供了更优平台，有望加速IPF治疗策略的临床转化。研究还揭示了上皮-间质相互作用在纤维化进展中的关键作用，为理解IPF病理生理学提供了新视角。