基于DIA质谱的巨噬细胞TLR4信号通路磷酸化修饰全景图谱研究

《Scientific Data》：Phosphoproteomic profiling of lipopolysaccharide stimulated toll-like receptor pathways in macrophages

本研究针对TLR4信号通路磷酸化景观不完整的技术瓶颈，采用数据非依赖采集（DIA）质谱技术深度解析LPS刺激下巨噬细胞的磷酸化动态变化。研究发现DIA方法相比传统DDA技术显著提升磷酸化位点鉴定数量（特别是酪氨酸磷酸化位点增加10倍），揭示TLR4通路中关键激酶调控网络和新型磷酸化蛋白功能，为炎症性疾病治疗靶点发现提供重要数据资源。

　　

当细菌入侵人体时，免疫系统会立即启动防御机制。其中，巨噬细胞作为先天免疫的重要成员，通过细胞表面的Toll样受体4（TLR4）识别革兰氏阴性细菌细胞壁成分脂多糖（LPS），从而激活下游信号通路。TLR4信号传导依赖于髓样分化因子88（MyD88）和TIR结构域包含适配器诱导干扰素-β（TRIF）两条主要通路，最终诱导促炎细胞因子和I型干扰素的产生。蛋白质磷酸化作为一种关键的翻译后修饰，在TLR4信号转导中扮演着分子开关的角色，然而由于技术限制，TLR4信号通路的磷酸化景观仍不完整。

传统的数据依赖采集（DDA）质谱技术在磷酸化蛋白质组学研究中存在灵敏度不足和覆盖度有限的问题，特别是对于低丰度的酪氨酸磷酸化位点检测效果不佳。这导致我们对TLR4信号通路中磷酸化动态变化的认知存在显著空白，难以全面理解细胞因子风暴等病理过程的分子基础。

为解决这一技术挑战，Doeun Kim等研究人员在《Scientific Data》发表了题为"Phosphoproteomic profiling of lipopolysaccharide stimulated toll-like receptor pathways in macrophages"的研究论文。该研究采用数据非依赖采集（DIA）质谱技术，结合传统的DDA方法，系统分析了LPS刺激下永生化骨髓来源巨噬细胞（iBMDMs）中磷酸化动态变化，建立了迄今为止最全面的TLR4信号通路磷酸化图谱。

研究团队主要运用了以下关键技术方法：首先建立LPS时间梯度刺激的iBMDMs模型（0、5、30分钟），每个时间点设置5个生物学重复；其次采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术平台，分别进行DDA和DIA数据采集；通过TiO₂和Fe-NTA顺序富集策略提升磷酸肽鉴定效率；利用Proteome Discoverer和Spectronaut软件进行数据分析，并采用seqknn算法进行缺失值填补；最后通过Western blot验证关键磷酸化事件，确保数据可靠性。

磷酸化信号验证

研究人员首先通过Western blot验证了LPS刺激后关键信号分子的磷酸化水平。结果显示，磷酸化JNK、p38和p65在LPS刺激后显著激活，而通过泛磷酸丝氨酸和泛磷酸苏氨酸/酪氨酸抗体的检测表明总蛋白磷酸化水平相对稳定。Coomassie blue染色证实了样品加载量的一致性，为后续质谱分析提供了质量保证。

DIA与DDA技术比较

研究团队对DIA和DDA两种质谱采集方法进行了系统比较。主成分分析显示两种方法都能清晰区分不同时间点的磷酸化谱。DIA方法共鉴定到21,761个磷酸肽，显著高于DDA的13,894个。在定量分析方面，DIA成功定量12,710个磷酸肽，而DDA为10,023个。特别值得注意的是，DIA在酪氨酸磷酸化位点的检测上表现出巨大优势，定量到340个磷酸酪氨酸位点，是DDA方法（29个）的10倍以上。

差异磷酸化分析

通过火山图分析，研究人员发现在5分钟LPS刺激组中，DDA方法鉴定到105个显著上调和43个下调的磷酸肽，而DIA方法鉴定到223个上调和197个下调磷酸肽。在30分钟刺激组中，DIA检测到的差异磷酸肽数量（736个上调和381个下调）同样是DDA方法（398个上调和93个下调）的近两倍。这一结果进一步证实了DIA技术在动态磷酸化事件检测中的高灵敏度。

功能富集分析

基因本体和KEGG通路富集分析显示，LPS刺激30分钟后显著调控的磷酸化蛋白主要富集在细胞周期调控、激酶/磷酸酶结合活性等生物学过程。炎症相关通路如耶尔森菌感染、FcγR介导的吞噬作用和自噬等在DDA和DIA数据集中均显著富集。值得注意的是，DIA数据额外识别出TNF信号通路为显著富集通路，体现了其在信号通路识别方面的优势。

时间点特异性磷酸化分析

研究人员还分析了不同时间点特异性的磷酸化事件。在次要数据矩阵中，DIA方法定量到4,867个磷酸肽，是DDA方法（1,257个）的4倍。其中30分钟LPS刺激组特异性磷酸肽数量最多（DIA：1,270个；DDA：233个），而5分钟刺激组特异性磷酸肽数量最少。这种时间特异性的磷酸化动态为理解TLR4信号通路的时序调控提供了重要线索。

本研究通过系统比较DIA和DDA在磷酸化蛋白质组学分析中的性能，证实了DIA技术在TLR4信号通路研究中的显著优势。该技术不仅大幅提升了磷酸化位点的鉴定数量和定量准确性，更重要的是实现了对低丰度酪氨酸磷酸化事件的高效捕获。研究发现DIA方法能够识别到多个TLR4信号通路中此前未被报道的酪氨酸磷酸化蛋白，包括RNA剪接因子和ErbB信号通路调控因子，这些发现为理解先天免疫调控机制开辟了新视角。

该研究建立的全面磷酸化数据集为后续研究提供了宝贵资源，有助于深入解析TLR4信号通路的精细调控网络。特别值得注意的是，DIA技术在不依赖酪氨酸磷酸化抗体富集的情况下，成功实现了对大量酪氨酸磷酸化位点的鉴定，这一技术突破将为研究其他信号通路中低丰度磷酸化事件提供重要参考。研究人员表示将在后续研究中利用DIA方法深入探索磷酸化蛋白的时序动力学，并通过生物学实验验证新发现的酪氨酸磷酸化蛋白功能。

这项研究不仅深化了我们对TLR4信号通路磷酸化调控的理解，更重要的是建立了一套高效、可靠的磷酸化蛋白质组学分析流程，为炎症性疾病、自身免疫病和癌症等疾病的分子机制研究和治疗靶点发现提供了重要的技术平台和数据基础。