细胞传代次数诱导转录组漂移：影响实验可重复性的一个被忽视的关键因素

《Scientific Reports》：Cell passage number drives transcriptomic drift as an overlooked factor in experimental reproducibility

本研究针对细胞实验可重复性差的问题，系统研究了细胞传代次数这一内在因素对转录组稳定性的影响。通过对ACHN和Renca两种肿瘤细胞系从P3到P39的RNA-seq分析，发现中期传代细胞呈现显著的转录组波动，涉及细胞周期、代谢和应激反应等关键通路。研究结果为提高细胞实验可靠性提供了重要理论依据，强调严格控制传代次数的重要性。

　　

在生命科学研究快速发展的今天，一个令人担忧的现象正悄然侵蚀着科学发现的可信度——实验结果的不可重复性。2016年《自然》杂志的一项调查显示，近80%的生物学家无法重复他人的实验结果，甚至60%的研究人员连自己的实验都无法重现。这种"可重复性危机"不仅阻碍科学进步，更造成巨大的人力物力浪费。

细胞培养作为现代生命科学研究的基石技术，在基因表达调控、药物筛选和疾病机制研究等领域发挥着不可替代的作用。然而，不同实验室使用同一细胞系却常常得到迥异的结果，这背后的原因成为科学家们亟待解开的谜团。

以往研究多聚焦于外部因素：细胞系交叉污染、支原体感染、胎牛血清批间差异等都被确认为重要干扰因素。但一个更为隐蔽的内在因素——细胞传代次数，却长期被研究者忽视。细胞在体外连续传代过程中，其基因表达谱是否会发生系统性变化？这种变化如何影响实验结果的可重复性？这些问题成为深圳市第四人民医院和龙岗中心医院研究团队关注的焦点。

研究人员假设，细胞传代次数是影响实验可重复性的关键内在因素，通过诱导转录组动态变化发挥作用。为验证这一假说，他们选取两种常用肿瘤细胞系——人肾癌细胞ACHN和小鼠肾癌细胞Renca，从冻存复苏后连续传代至第39代，并在关键传代点采集细胞进行RNA测序分析。这项发表在《Scientific Reports》的研究，首次系统揭示了细胞传代过程中转录组的非线性变化规律。

研究采用的主要技术方法包括：细胞培养与连续传代、RNA提取与质量检测、文库构建与Illumina平台测序、生物信息学分析。研究人员对两种肿瘤细胞系进行长期培养，在P3、P10/P11、P17、P24和P39五个关键传代点采集样本，通过RNA测序技术全面分析转录组动态变化，并利用差异表达基因分析、主成分分析、功能富集分析等方法深入探索传代效应的分子机制。

转录组分析揭示传代相关基因表达变化

通过RNA测序技术，研究人员对两种细胞系在不同传代点的转录组进行全面分析。基因表达分布图显示各时间点表达水平分布相似，表明数据质量一致。主成分分析呈现明显规律：随着传代次数增加，细胞在主成分空间中逐渐分散，表明连续传代导致基因表达谱发生显著改变。样本相关性热图进一步证实，相同传代点的生物学重复具有高度一致性，而不同传代点间存在渐进性转录组分化，支持长期培养过程中转录组的系统性重塑。

差异表达基因数量呈现非线性模式

以早期传代细胞为参照，研究人员量化了各传代点的差异表达基因数量。在ACHN细胞中，P10相比P3出现1，276个上调基因和871个下调基因；P17时差异基因数量减少至854个上调和450个下调；而更高传代点的差异基因数量显著降低。Renca细胞呈现相同趋势：P11相比P3有1，168个上调和1，014个下调基因；P17时降至562个上调和597个下调；到P39仅剩201个上调和126个下调基因。这种"中间波动，两端稳定"的非线性模式，提示细胞在传代过程中经历动态的转录组重塑而非简单的线性变化。

基因表达谱动态变化具有功能相关性

聚类热图分析显示，两种细胞系在连续传代过程中均出现多基因的显著表达波动。ACHN细胞中，包括PDK2、PDK4和DBF4在内的基因呈现明显表达变化，提示这些基因可能参与代谢调控和细胞周期控制等关键生物学过程。Renca细胞中，Btbd17、Loxl3、Raf1和Acvrl1等基因表达动态变化，可能与信号转导、转录调控和癌症相关通路密切相关。这些发现表明，长期体外培养过程中基因表达模式发生系统性重塑，反映了细胞对培养环境的主动或被动适应。

功能富集分析揭示传代相关生物学过程

基因本体富集分析显示，在两种细胞系中，低传代与中传代比较的差异基因主要富集于细胞周期调控、生物调控、代谢过程和应激反应等基础生物学过程，表明中传代细胞具有更高的转录活性和调控敏感性。随着传代增加，显著富集的功能类别逐渐减少，P3与高传代比较时仅剩有限功能类别富集，与差异基因数量减少趋势一致。分子功能层面，富集术语主要涉及结合、催化活性和转运活性；细胞组分分析显示富集于细胞解剖实体和蛋白质复合物。这些结果提示连续传代可能导致功能多样性和反应性逐渐丧失，反映长期培养细胞转录谱的稳定化趋势。

KEGG通路分析显示关键信号通路改变

KEGG通路富集分析发现，在ACHN细胞中，P3与P10比较的差异基因显著富集于信号转导、传染病、全局代谢和免疫系统等关键通路，内分泌代谢疾病、癌症相关通路和转录调控也有明显富集。随着传代增加，富集通路数量和差异基因计数显著减少，但环境信息处理通路保持一定富集水平。Renca细胞呈现一致趋势，P3与P11比较显示广泛的通路激活，特别是信号转导、传染病、全局代谢和免疫系统通路富集显著。这些结果表明，中传代阶段可能是检测药物干预效应的最佳窗口期。

研究结论与意义

这项研究系统揭示了一个长期被忽视的重要因素——细胞传代次数对实验可重复性的深刻影响。通过两种肿瘤细胞系的转录组分析，研究人员发现基因表达变化呈现显著的非线性模式：中期传代细胞表现出最活跃的转录状态，涉及细胞周期、代谢和应激反应等关键生物学过程；而低传代和高传代细胞则呈现相对稳定的转录谱。这种传代依赖的转录组漂移现象，为解释细胞实验结果的不可重复性提供了新的理论框架。

研究的实际意义在于为细胞实验标准化提供了明确指导。研究人员建议在实验设计中严格限定传代次数范围，并在发表研究成果时明确报告所使用的细胞传代信息。这些简单易行的措施，有望以最小成本显著提升细胞实验的可重复性。

该研究的创新性在于首次系统描绘了连续传代过程中转录组的动态变化轨迹，将传代次数从单纯的技术参数提升为影响实验结果的关键生物学变量。然而，研究也存在一定局限性，如仅使用两种肾癌细胞系，生物学重复数量有限，且未深入探索表观遗传调控等分子机制。未来研究需要在更多细胞模型和培养条件下验证这一现象，并建立分子变化与功能结果间的直接联系。