DNA连接酶IIIα通过精氨酸锚定核小体：单分子动力学揭示染色质DNA断裂修复新机制

《Nature Communications》：The zinc finger of DNA ligase 3α binds to nucleosomes via an arginine anchor

本研究利用单分子SMADNE技术，首次揭示了DNA连接酶IIIα（LIG3α）通过其锌指结构域（ZnF）中的精氨酸锚（R62/R64）高亲和力结合未损伤核小体的新机制。该发现突破了传统认知中LIG3α/XRCC1复合物仅在DNA损伤修复中发挥作用的局限，为阐明染色质环境下单链断裂修复的时空动态调控提供了关键理论依据。

　　

在细胞核内，DNA无时无刻不面临着内源性和外源性因素的攻击，产生各种类型的损伤。其中，DNA单链断裂（SSB）是最常见的损伤形式之一，如果得不到及时修复，将会导致基因组不稳定，进而引发细胞凋亡、衰老甚至癌变。负责修复这些断裂的关键"分子缝合线"是DNA连接酶，而人类细胞中主要有三种DNA连接酶：LIG1、LIG3和LIG4。其中，DNA连接酶IIIα（LIG3α）与支架蛋白XRCC1形成的复合物，在碱基切除修复（BER）和单链断裂修复（SSBR）通路中扮演着不可或庖的角色。

与其它连接酶不同，LIG3α拥有一个独特的N端锌指结构域（ZnF），这个结构域与PARP1蛋白的锌指结构高度相似，被认为在DNA损伤感应中发挥作用。然而，细胞核中的DNA并非"裸露"存在，而是与组蛋白紧密缠绕，形成被称为核小体（NCP）的基本染色质结构单元。这种高度压缩的包装方式在保护DNA的同时，也为修复蛋白识别和接触损伤位点设置了巨大障碍。长期以来，科学家们一直困惑于LIG3α/XRCC1复合物是如何在如此拥挤的染色质环境中精准定位并修复DNA断裂的。传统生化研究通常使用短DNA片段，其游离末端会干扰结合动力学的准确测量，且无法模拟生理状态下染色质的真实情况。因此，在更接近生理条件的背景下，实时、动态地观察LIG3α/XRCC1复合物如何与染色质相互作用，成为了领域内一个亟待解决的关键科学问题。

为了回答这一难题，由Bennett Van Houten教授领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项突破性研究。他们利用先进的单分子分析技术，首次在实时、动态的水平上揭示了LIG3α通过其锌指结构域中的"精氨酸锚"与核小体结合的全新机制，颠覆了人们对DNA连接酶功能的认识。

研究人员主要运用了单分子核提取物DNA结合蛋白分析（SMADNE）技术，该技术结合光学镊子（LUMICKS C-Trap）和共聚焦成像，能够在接近生理条件的核提取物中，实时观察荧光标记的蛋白质在长DNA底物上的结合动力学。研究使用了包含可连接切口、核小体或核小体内嵌入切口的多种DNA底物。此外，通过点突变、结构域缺失构建体以及体外生化连接实验，验证了关键功能域和残基的作用。核小体在Widom 601序列上重构，并通过蔗糖梯度离心纯化。

结合动力学揭示LIG3α与XRCC1的非强制性异源二聚体关系

研究人员首先利用SMADNE技术分析了Halo635标记的LIG3α和YFP标记的XRCC1在含有8个可观察切口的λDNA上的结合行为。出乎意料的是，尽管传统观点认为LIG3α必须与XRCC1形成异源二聚体才能发挥功能，但单分子数据显示，LIG3α（K_D = 0.12 nM）对切口DNA的亲和力比XRCC1（K_D = 1.5 nM）高出约15倍。大多数结合事件是LIG3α（56.8%）或XRCC1（26.1%）的独立结合，两者共定位的事件仅占17.1%。在共定位事件中，LIG3α通常先于或与XRCC1同时到达切口位点，而XRCC1先到达的情况则非常罕见。这表明在实验浓度下，两种蛋白有相当一部分是独立行动的，LIG3α在切口识别中占主导地位。

可视化切口连接与腺苷酸化状态的影响

通过观察结合位点随时间的减少，研究人员测算出LIG3α的实际连接速率约为0.37 s^-1，与之前报道的腺苷酸转移步骤（催化限速步骤）的速率常数接近。生化分析进一步表明，在核提取物中约有33%的LIG3α分子在制备过程中已预先腺苷酸化。当使用去除5‘磷酸（5’-P）的切口DNA（留下不可连接的5‘羟基，5’-OH）时，LIG3α的结合亲和力显著降低（K_D 从0.12 nM降至1.6 nM），共定位事件也减少，证实5‘-P对于LIG3α的有效结合和催化至关重要。同样，催化失活突变体LIG3α(K421A)也表现出结合寿命缩短和亲和力下降，说明K421及其腺苷酸化状态有助于切口结合。

催化核心与锌指结构域在切口识别中的协同与竞争

为了探究锌指结构域（ZnF）的作用，研究人员比较了野生型（WT）、缺失ZnF的突变体（ΔZnF）以及仅包含ZnF和BRCT结构域的片段（ZnF-BRCT）的结合特性。ΔZnF突变体对切口的亲和力（K_D = 0.93 nM）与野生型相近，而ZnF-BRCT片段的亲和力则大幅减弱（K_D = 3.2 nM）。ΔZnF具有更快的结合速率（k_on），而ZnF-BRCT的结合速率则慢得多。这些数据表明，ZnF和催化核心（CC）在切口识别中协同工作，WT LIG3α可能通过一个快速的"手递手"机制，由ZnF初始感应切口，然后交由CC进行催化。

LIG3α通过精氨酸锚高亲和力结合未损伤核小体

最令人惊讶的发现是，LIG3α对重建在601序列上的未损伤核小体（UD-NCP）表现出极高的亲和力（K_D = 0.04 nM），甚至比其对裸露DNA上切口的亲和力更高（K_D = 0.12 nM）。XRCC1对核小体的亲和力则远低于LIG3α。域分析表明，ZnF-BRCT片段足以介导与核小体的高亲和力结合，而ΔZnF突变体则完全丧失了结合能力。进一步的点突变实验证实，ZnF结构域中的R62和R64这两个精氨酸残基是结合所必需的，它们作为"精氨酸锚"与核小体组蛋白H2A-H2B二聚体表面的酸性区相互作用。这是首次发现精氨酸锚存在于一个锌指结构域中。

核小体内切口位置影响LIG3α的结合动力学

研究人员还在核小体DNA的不同超螺旋位置（SHL 0, -2.5, -4.5）引入了不可连接的切口，以模拟染色质环境下的损伤。结果显示，LIG3α在所有含切口的核小体上的结合寿命均短于未损伤核小体，其中SHL-4.5位置的结合寿命最长，亲和力最高。结合动力学符合双相指数衰减，提示存在长时间的ZnF与核小体结合事件和短时间的切口感应事件。这表明，当切口存在时，LIG3α的ZnF会从相对稳定的核小体结合状态切换到快速的切口感应状态，切口的位置（尤其是靠近酸性区的SHL 0）会与核小体结合竞争，从而降低总体停留时间。

本研究通过创新的单分子技术，颠覆性地揭示了LIG3α不仅是一个DNA修复酶，更是一个染色质结合蛋白。其通过锌指结构域中的精氨酸锚（R62/R64）预先定位在未损伤的核小体上，这一"预定位"机制可能使其能够快速响应染色质中发生的DNA损伤。研究还明确了LIG3α与XRCC1在生理条件下并非总是以严格的异源二聚体形式工作，LIG3α在切口识别中起主导作用。这些发现为深入理解染色质环境下DNA修复的精确调控机制提供了全新的视角，对揭示相关神经系统疾病（如某些类型的共济失调）的发病机制以及开发新的治疗策略具有重要意义。此外，LIG3α与核小体的高强度结合也暗示了其在转录、复制等染色质结构动态变化过程中可能扮演着尚未被认识的角色，拓宽了未来研究的方向。