多组学分析揭示肺炎链球菌非典型糖利用模式及膜脂稳态调控新机制FasR

《Nature Communications》：Multi-omics profiling reveals atypical sugar utilization and a key membrane composition regulator in Streptococcus pneumoniae

肺炎链球菌如何适应人体内迥异的微环境是其致病的关键。为解析其适应机制，研究人员通过CRISPRi-seq、RNA-seq和蛋白质组学等多组学技术，系统描绘了该菌在不同感染模拟条件下的基因适应性、转录及蛋白表达全景图。研究发现，肺炎链球菌对N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的利用挑战了传统的葡萄糖偏好认知，并揭示了GlcNAc摄取后降解受阻会导致毒性。更重要的是，研究鉴定出一个全新的脂肪酸饱和度调控因子FasR(SPV_0647)，它通过调控fabM等基因维持膜脂稳态，对细菌抵抗热应激至关重要。该研究为理解病原体环境适应及开发抗感染策略提供了新视角。

　　

肺炎链球菌是一种既能定植于人体鼻咽部，又能入侵肺部、血液或脑脊液引发严重感染的机会性病原体。这种非凡的适应能力意味着它必须能快速应对不同宿主微环境带来的挑战，包括营养差异、温度波动和免疫压力等。然而，驱动这种广泛适应性的具体分子机制和遗传基础，尤其是许多基因的功能，仍然不甚清晰。理解肺炎链球菌如何在不同环境中生存和致病，对于开发新的干预措施具有重要意义。

为了深入探究肺炎链球菌的环境适应机制，研究人员在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们采用多组学整合分析策略，系统描绘了肺炎链球菌在模拟不同感染部位（如鼻咽部、肺部、脑脊液，并考虑发热状态）条件下，全基因组水平的基因适应性（通过CRISPRi-seq技术）、基因表达（转录组学）和蛋白质丰度（蛋白质组学）的动态变化。

研究团队运用了多种关键技术方法。他们利用可诱导的dCas9-sgRNA文库进行全基因组CRISPRi-seq筛选，在不同感染模拟条件下定量每个基因的适应性效应。通过RNA测序(RNA-seq)分析基因转录水平的变化，并采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)进行定量、无标记的蛋白质组学分析，检测蛋白质表达情况。利用气相色谱-质谱联用(GC-FAME)技术分析细菌膜脂肪酸组成。通过生物信息学工具（如DESeq2、MOFA2、FoldSeek）进行多组学数据整合、差异分析和结构预测。并构建基因敲除、回补和过表达菌株，通过生长曲线、葡萄糖摄取测定等进行表型验证。

感染相关环境塑造独特的适应性图谱

研究人员首先利用CRISPRi-seq技术在多种模拟感染环境的培养基中进行了全基因组适应性筛选。结果显示，不同的生长条件导致了明显不同的适应性图谱。共有362个操纵子（对应615个基因）表现出条件依赖性的适应性效应，同时鉴定出一个由139个操纵子（259个基因）组成的核心必需基因组。营养可用性，特别是复杂培养基和化学成分确定的培养基之间的差异，是造成适应性差异的主要因素。值得注意的是，氨基酸糖N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的存在导致了显著的适应性变化，其分解代谢基因nagA和nagB在仅含GlcNAc的培养基中是必需的。

非典型糖利用：GlcNAc挑战葡萄糖偏好范式

对GlcNAc代谢的深入研究发现，nagA和nagB的缺失不仅导致细菌无法在以GlcNAc为唯一碳源的培养基中生长，更令人惊讶的是，即使在葡萄糖和GlcNAc等摩尔混合的条件下，缺失株也表现出严重的生长缺陷。进一步分析发现，在GlcNAc存在的情况下，野生型肺炎链球菌对葡萄糖的摄取速度显著减慢，而ΔnagA和ΔnagB突变体则完全无法在相同时间内耗尽培养基中的葡萄糖。这表明，即使存在被认为是最优碳源的葡萄糖，肺炎链球菌仍会摄取GlcNAc。如果GlcNAc被摄取但无法被nagA/B有效分解，可能导致毒性中间产物（如糖磷酸）的积累，从而抑制生长。研究人员还通过筛选抑制突变株，证实了GlcNAc的摄取（主要依赖manLMN转运系统）与其分解代谢的耦合至关重要。这些发现对肺炎链球菌中经典的CcpA介导的碳分解代谢抑制（CCR）机制提出了挑战，表明在自然栖息地（鼻咽部）中更丰富的GlcNAc可能具有重要的生态意义。

热应激施加特定的遗传需求

在模拟发热条件（40°C）的CRISPRi-seq筛选中，研究人员观察到了独特的热应激特异性适应性效应。一方面，某些基因（如精氨酸代谢调节因子argR1和ahrC，以及多胺合成通路相关基因）的敲低带来了适应性优势，提示精氨酸保留可能在高温下有益。另一方面，已知的热休克蛋白基因（如groEL/ES, dnaK操纵子）的敲低导致严重的适应性缺陷。最显著的热应激特异性适应性缺陷是由一个此前与热应激无关的双基因操纵子comEB-spv_0647的敲低引起的。验证实验表明，是spv_0647，而非comEB，的缺失导致了细菌在高温下的生长缺陷。

FasR (SPV_0647) 通过调控FabM介导的脂肪酸饱和度平衡来维持高温下的膜稳态

由于spv_0647编码一个推测的转录调节因子（TetR家族），研究人员通过转录组学分析发现，Δspv_0647突变体在37°C下出现全球性转录组紊乱，并伴有脂肪酸代谢关键基因（如fabM, fakB3）的下调。推测其功能失调可能影响膜脂组成，进而破坏高温下的膜完整性。生物信息学分析（FoldSeek）预测SPV_0647的蛋白结构与多个能感知或结合脂肪酸的TetR家族转录调节因子相似。遗传互作分析（双CRISPRi-seq数据）也显示spv_0647与fakA、fabM等脂肪酸代谢基因存在功能关联。最关键的表型挽救实验表明，在Δspv_0647突变体中过表达fabM（负责不饱和脂肪酸合成的关键酶），而非fakB3，能够显著恢复其在高温下的生长能力。通过GC-FAME对膜脂肪酸组成的直接分析证实，Δspv_0647突变体在高温下膜脂中饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例(SFA:UFA)显著升高，平均酰基链长度也发生改变，而这些异常都能被spv_0647的回补或fabM的过表达所纠正。因此，研究人员将SPV_0647命名为FasR（脂肪酸饱和度调节因子），认为其通过正调控fabM（可能还有fakB3）来维持适当的膜脂SFA:UFA平衡，从而赋予肺炎链球菌耐热性。

多组学整合揭示表达与适应性之间的正交关系

研究人员进一步对肺炎链球菌在6种感染模拟条件下的转录组和蛋白质组进行了整合分析（MOFA）。结果显示，条件特异性的转录组-蛋白质组景观清晰可辨，主要差异表达程序包括自然感受态激活、群体感应系统（rtg, vp1 loci）以及特定糖（如蔗糖、氨基酸糖）利用途径的调控。重要的是，将多组学表达数据与CRISPRi-seq适应性数据进行比较发现，基因的表达变化与其适应性需求之间几乎没有相关性，呈现出明显的正交关系。例如，GlcNAc利用所需的manLMN、nagA和nagB基因在生长过程中并不差异表达，而其他差异表达的氨基酸糖代谢基因则非必需。这表明，表达谱和适应性谱提供了几乎完全互补的信息，共同揭示了细菌适应环境的复杂策略。

该研究通过多组学整合分析，深入揭示了肺炎链球菌适应宿主不同微环境的精细调控网络。研究不仅挑战了关于肺炎链球菌碳源偏好的传统认知，揭示了GlcNAc代谢的特殊性及其潜在毒性，更重要的是发现并鉴定了一个全新的膜脂稳态关键调控因子FasR。FasR通过调控脂肪酸饱和度平衡，在细菌应对温度变化（如发热）这一关键感染相关压力中扮演着不可或缺的角色。研究表明，基因的表达调控和功能必需性是两个相对独立的层面，共同构成了细菌适应环境的基础。这一认识强调了多组学方法在系统生物学研究中的重要性，对于全面理解病原菌的致病机制和寻找新的抗菌靶点具有深远意义。研究所产生的大规模基因组适应性、转录组和蛋白质组数据已整合进在线基因组浏览器PneumoBrowse 2，为科研社区提供了宝贵的资源。